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标题: 原位杂交步骤 [打印本页]

作者: dingwei 时间: 2001-6-7 23:51 标题: 原位杂交步骤

                  原位杂交步骤

1．切片脱蜡至75%酒精。
2．37℃干燥5分钟
3．蛋白酶K 37℃  15分钟
4．去垢剂（DW）洗5分钟
5．酒精脱水（75%  95%  100% 依次）
6．干燥 37℃ 5 分钟或室温15-30分钟
杂交：
1．加生物素化探针，盖上塑料膜
2．变性，95℃ 8-10 分钟
3．退火，快速冷却
4．杂交，37℃  2-16 小时
5．蛋白封闭液1X除去塑料膜，37℃  洗3-5 分钟
6．蛋白封闭液2X  37℃ 洗3-5 分钟
7．加鼠抗生物素 37℃  30分钟
8．去垢剂DW液洗
9．加生物素化羊抗鼠Ig 37℃  20分钟
10．去垢剂DW液洗
11．加碱性磷酸酶-链霉蛋白结合物 37℃  20分钟
12．去垢剂DW液洗
13．显色，加酶底物 10-40 分钟（显微镜下控制）
14．蒸馏水洗
15．核固红复染脱水透明封固
   注：蛋白封闭液1X及蛋白封闭液2X用前加热至37℃，其余试剂用前置于室温；玻片不能在杂交过程中干燥。蛋白酶K浓缩液需在-20℃保存，稀释好的蛋白酶K(1:10)在室温下只能稳定1个小时。如是细胞片应在冷丙酮下固定10分钟。

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