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标题: 请教王华老师，冰冻问题 [打印本页]

作者: 梅花 时间: 2011-12-27 22:40 标题: 请教王华老师，冰冻问题

我最近做的冰冻细胞收缩，具体步骤：肺癌组织冰冻切片（没用电吹风吹）10%中性甲醛5秒—95%乙醇5秒—同常规HE染色至水洗，染哈瑞氏苏木素时间同常规，后面步骤也同常规。然后先后分别改用甲醇、95%酒精、AF、还有就是你介绍的固定液30秒—1分钟，这几种固定液染出来核有点灰，很郁闷，是否这几种含醇类的固定液染色要久些，如何才能做到不收缩，细胞核又清晰？

作者: 王华 时间: 2011-12-28 12:13 标题: 回复 1# 的帖子

10%中性甲醛5秒，时间太短，甲醛还没有来得及反应，根本没起到固定的作用。
10%中性甲醛5秒——95%乙醇5秒，这样操作的结果是：组织细胞收缩非常明显，比直接用95%乙醇固定引起的细胞收缩更明显。原因：甲醛时间太短没有起到固定作用，只起到组织“浸水”的作用，组织含有游离水的时候用95%固定，细胞收缩是非常明显的。
   甲醛是交联型固定剂，也就是要和蛋白质产生化学反应，反应过程本质是得失电子，缩合反应，是需要时间的。
   做冰冻有几点要注意：一、取材后一定要把组织用吸水纸吸干表面的游离水后再冻（肺癌组织从手术室下来使一般都是很湿润的）；二、贴片后立即固定，固定时间2分钟（俺们的固定剂因为酒精浓度不高，脱水反应不剧烈，甲醛与苦味酸都是反应型固定剂，要固定充分就需要保证时间）；三、用饱和碳酸锂溶液返兰（用含有苦味酸的固定剂时）；四、切片经脱水透明后封片，不能晾干或吹干封片。
   做冰冻需要速度，但不是无限度的快，必须保证质量的基础上快！否则，快就没有任何意义，反而起反作用！
   试一试吧！

作者: 梅花 时间: 2011-12-28 22:33

感谢王华老师的回复，我用10%中性甲醛固定时间延长到1分，收缩更明显，改用贴片后直接用甲醇或95%洒精固定30-60秒，细胞不收缩但是核染色稍灰，是固定时间不够还是染色时间太短？我准备按你说的试试，延长固定时间，用吸水纸吸干表面水，看效果如何。

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