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标题: 请教各位老师细胞固定问题！ [打印本页]

作者: merry70 时间: 2015-5-8 16:53 标题: 请教各位老师细胞固定问题！

一直以来，自己认为细胞固定20分钟到30分钟足够了。可是昨天被告知穿刺细胞固定一定要一直浸在固定液中，哪怕一整夜，直到染色时再从固定液中取出。如果固定30分钟后取出，过几个小时染色会使得细胞退化变形。请问是不是真是这样？而我的认知是觉得细胞制片后要即刻固定，干燥后固定细胞会蜕变。至于固定充分后取出，晚些染色对细胞不会有影响。我的观点是否正确？

[ 本帖最后由 merry70 于 2015-5-8 17:15 编辑 ]

作者: merry70 时间: 2015-5-10 21:11

答案已经知道了。确实是我的以往的观念有误。细胞片从固定液中出来应该直接浸入苏木素开始染色。这样细胞不会变形，尤其对于穿刺细胞等更加应该这样。

作者: mbw 时间: 2015-7-8 14:32

固定决定染色与诊断质量
（一）细胞固定的方法
所谓固定，就是用各种固定剂使细胞内的物质尽量接近其活体状态时的形态结构和位置的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物、酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构和活体时相仿。
在细胞涂片制片过程中，及时固定是非常关键的一步，关系到能否对这些细胞做出正确的判断。这包含了二方面的意思：一是尽可能保证送检标本的新鲜，二是制片完成后要迅速固定。相对后者，保证送检标本的新鲜也显得十分重要，就个人经验而言，一般经过固定处理的标本（除针吸细胞需立即制片外）在室温下2-4h内进行染色处理是合适的，细胞的退变并不十分明显；真正引起细胞退变的是在制片时，细胞核染色质结构的变化和细胞在干燥过程中迅速的物理力学变化所引起，也就是说，快速的湿片固定是制片的关键，并不是湿式固定的细胞不发生力学变化，其发生的是收缩变化，不影响染色质的形态改变，只是细胞体积略微变小一点而已。一张合格的细胞涂片，必须能够清楚的看到细胞核的结构，即核膜、核仁、染色质的质点和完整的细胞形态与结构。
1湿式固定法
标本在经涂片后固定的方法至关紧要，我国已故细胞病理学家、病理学家马正中教授生前曾在多次全国性的学术会议上发表演讲，讲述他亲自做的关于标本进入固定液的时间与细胞着色、外形退变以及影响诊断的相关研究。马正中教授指出，采用湿式固定的效果最佳。将细胞标本制作完成后，在细胞新鲜而湿润时，立即放入以醇性溶液为主的固定液（95%乙醇、无水乙醇、甲醇、乙醚酒精等）内，称湿式固定法。固定的时间一般常规制片应在1～3h左右为宜，快速涂片在轻薄和均匀的情况下5-10min左右即可，但要注意多做几张涂片备用并至少留一张作常规染色。
这种方法是目前最好的固定方法，可以完好的保存细胞内的各种结构，对正确认识各种细胞的性质，减少细胞学的误诊有很大的帮助。在痰涂片、妇科涂片、穿刺物涂片、各种刷片、食道拉网涂片、肿块组织印片等水分较少的标本上使用非常方便，但在胸腹水、尿、心包积液、脑脊液等含水量较高的标本制作时，需要一定的技术，才能避免细胞的脱落。
细胞经过湿式固定后，应该直接从固定液内拿出放入蒸馏水中稍作加水，置染色液中染色。无需水洗或干燥，水洗容易使细胞脱落，也不能干燥，因为涂片干燥会导致细胞显示人为退变或使细胞卷曲，同时造成细胞着色不佳和核周围皱折。也就是说无论在固定前还是固定后细胞干燥都会导致细胞着色不良，显示退变样结果。
湿式固定后使用的固定液，在一定时间内要过滤或更换，防止脱落的细胞相互污染。在固定和染色时，最好能将痰与其他液体标本分开处理，在痰标本较多的实验室应另设专门的染色液，妇科标本也应参照这种做法。尽可能不要各种标本混合使用一套固定液或染色液染色。如标本量较少的实验室可采取使用前过滤，以避免相互间造成污染。痰标本内黏液多，很容易吸附固定容器内漂浮的其他标本在固定时脱落的细胞或微粒细胞碎片等，造成人为的污染，有时会在不该出现的标本内容物出现在不相关的标本中从而导致误诊。一般情况下，大的实验室常规染色应设2-3套并尽可能将痰标本、体液标本、妇科宫颈标本以及穿刺标本分开固定和染色。总之，在潮湿状态下固定的涂片染色效果最佳。95%酒精固定液就应该及时更换，一般每周更换一次或每固定100张涂片后应更换固定液一次，以保持酒精的浓度在最佳状态。
2干式固定法：必须注意的是所谓干式固定并非久置致使干燥不固定，而是制片处理后立即进入固定液，经短时间内固定（一般在涂片潮干后固定30秒）后干燥1分钟，因为干燥片会影响染色的效果。标本若为粘稠物应立即固定；若为液体标本，在树起载玻片不流动的情况下即标本潮干下投入固定液，为防止收缩流动采用喷雾法固定或滴加法固定。特殊要求的不经固定的干燥片：将细胞标本制作完成后，干燥（自然或短时间文火加热）后染色或再放入固定液内固定后。这个方法只适用于有特殊要求（如姬姆萨和瑞氏染色等血液染色法），或者在湿片制作过程中由于细胞量太少，载玻片上水分过多，而又没有可以重新制作的标本量时，作为一种补救的方法。自然干燥的涂片细胞高度肿胀，核结构不清，似毛玻璃样；而加温干燥的细胞涂片如水分较少，和自然干燥的涂片相同，但如果水分较多，细胞会严重收缩，核浆深染，看不清结构。
3喷雾固定法：此方法为湿式固定法采用高压喷雾进行暂时性固定处理，在涂片制成后，将涂片平放，把固定液（含有酒精和油性物质或甲基化合物的混合物）喷洒在涂片上，静置至干燥，并在细胞表面形成一层薄膜，送至实验室再投入常规固定液中继续固定。染色前需放入水中浸泡10min。一般用于快速涂片诊断所需要的快速固定和进行血液染色方法（如瑞氏染色法）染色时的快速要求。不能将喷雾固定的效果等同于常规固定的效果，经喷雾固定后的干燥片染色时细胞的着色也会受到影响。
4液基细胞学的固定方法：与湿式固定法原理相同，只是先将各种细胞标本放入液基细胞的带有初步固定作用的“细胞保存液”（各厂家产品不尽相同，以乙醇、甲醇、丙酮等为主要成份，其浓度在30-50%以下）内预固定后，再经过机器或手工将细胞转移至玻璃片上，并将制好的涂片立即放入95%乙醇内再固定后进行染色，其效果与湿固定相同。

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