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标题: [求助]甲基绿-派洛宁染色 [打印本页]

作者: 319 时间: 2003-8-28 11:30 标题: [求助]甲基绿-派洛宁染色

丁老师和各位高手:我现在正在做甲基绿-派洛宁染色,但总是染不出书上所说的效果,尤其是甲基绿老是染不上色.不知该怎么办??染液怎么配??现在很苦恼.盼回复!!!感谢先.

作者: 临风揽月 时间: 2003-8-28 12:55 标题: [求助]甲基绿-派洛宁染色

  转丁老师的贴：
甲基绿派洛宁法（改良Cook，1974）
试剂配制：
（一）2%甲基绿水溶液：
甲基绿（methyl green）1g
蒸馏水加至50ml
用三氯甲烷抽提，方法详后。
（二）5%派洛宁水溶液：
派洛宁G（pyronine G）1g
蒸馏水加至20ml
（三）0.2M醋酸盐缓冲液（pH 4.8）
0.2M醋酸液41ml
0.2M醋酸钠液59ml
（三）甲基绿派洛宁染液：
2%甲基绿水溶液（经抽提） 5ml
5%派洛宁水溶液             1ml
蒸馏水                      12ml
0.2M醋酸盐缓冲液（pH 4.8）  18ml
甲基绿水溶液的抽提：甲基绿为绿色粉末，属三苯甲烷染料，这种染料是由氯代甲烷作用于结果晶紫而形成的一种化合物。由于甲基化作用，甲基绿就比甲基绿后，所引进的甲基连接得并不牢固，容易从甲基绿中脱失。另一方面，在甲基化过程中，还有一部分结晶紫并没有生成甲基绿，因此，也有人认为甲中，常有少量的甲基紫或结晶紫成份。但是，也有人认为甲基紫乃是甲基绿的衰败产物，甲基绿在储存过程中，会不断产生甲基紫。因此，在配制试剂时，必须先将甲基绿所含的甲基紫或结晶紫抽提出来，才能使细胞核内的脱氧核糖核酸染成绿色。抽提方法是取2%甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗，加入三氯甲烷20ml充分摇荡混合，使其内的甲基紫溶于三氯甲烷中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，慢慢把如此反复更换三氯甲烷，直到三氯甲烷无紫红色为止，即可得到得纯的甲基绿溶液。
操作步骤：
1、新鲜组织固定于Carnoy氏液（4℃）3~6小时，经95%酒精和无水酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。
2、切片经二甲苯脱蜡至蒸馏水。
3、置入甲基绿派洛宁染液于室温染30~60分钟。
4、取出切片，不经水洗，用滤纸吸干多余染液。
5、用丙酮迅速分化。
6、转入丙酮二甲苯（1:1）稍洗。
7、二甲苯透明2~3次。
8、中性树胶封固。结果：存在于胞质和核仁内的核糖核酸呈红紫色，胞核染色质内的脱氧核糖核酸绿色或绿蓝色。
对照方法：
1、取另一连续切片用核糖核酸酶（rihonuclease）1mg/1ml于37℃温箱内消化3小时，蒸馏水洗后置入甲基绿派洛宁染液内染色。
2、切片在10%高氯酸（prechloric acid）于4℃处理12~18小时，水洗后用1%碳酸钠液中和2分钟，流水冲洗5分钟，再用蒸馏水洗后置入甲基绿派洛宁染液内染色。经上述方法之一处理后的切片就为阴性。
注意事项：
1、组织不宜用甲醛固定，应选用Garnoy氏固定液，因为酒精和醋酸能较好地保存核蛋白。
2、Garnoy氏液固定标本的时间不宜太长，超过一天则染色效果不理想。
3、要注意试剂的质量，特别是派洛宁，常常不同批号的染料，染色的效果不同。甲基绿和派洛宁二者的比例要恰当。
4、染色液的pH应为4.8左右，如pH过低，甲基绿染色效果差；pH偏高，则派洛宁染色效果不良。
5、丙酮分化时间要很好掌握，时间不宜太长。
6、配妥的甲基绿派洛宁染液用后放冰箱保存，约可使用数周。
染色原理：对此法的染色原理，目前了解得还不够清楚，一般可从下面两方面理解。1、电离作用：脱氧核糖核酸和核糖核酸都有磷酸基，又有碱基，故为两性电解质。在一定的条件下，可以电离而带电荷，因此都有一定的等电点。甲基绿和派洛宁在水中电离后，都产生带阳电荷的离子。甲基绿电离后，在五价氮处产生二个正电荷，碱性较强。派洛宁电离后仅产生一个正电荷，碱性较甲基绿弱，在染色时二者进行竞争，碱性较强的甲基绿就与胞核（等电点pH3.8~4.2）进行极性吸着而结合，碱性较弱的派洛宁与胞质（等电点pH4.6~5.2）吸附结合。2、聚合作用：甲基绿对聚合高的DNA有亲和力，派洛宁对聚合低的RNA有亲和力。因此，思虑在绿选染DNA，而派洛宁选染RNA。应用：PNA主要存在于胞质及核仁内，它主导细胞的蛋白质合成。在细胞增生，胞质蛋白质合成亢进时，核仁和胞质的PNA增加。因此，恶性瘤细胞核仁巨大，胞质嗜碱。浆细胞和免疫母细胞胞质合成免疫球蛋白，胰腺上皮合成胰蛋白酶。因此，这些细胞胞质有很强的嗜碱性。胞质嗜碱，是蛋白质合成增强的标志。

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