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标题: 一种用于检测石蜡样本UGT1A1基因双位点多态性的方法 [打印本页]

作者: lvdou2000 时间: 2023-4-20 20:52 标题: 一种用于检测石蜡样本UGT1A1基因双位点多态性的方法

本研究在于建立一种同时检测石蜡样本中UGT1A1*28(-53TA6＞TA7)和UGT1A1*6(211G＞A)位点多态性的方法。

引物及Taqman探针设计：基于Cosmic数据公布的人类UGT1A1基因的UGT1A1*28(-53TA6＞TA7)和UGT1A1*6(211G＞A)多态性位点在内的上下游序列，设计特异性扩增包括上下游引物及不同的探针信号。对于引物及探针设计，采用Primer Express 3.0.1进行设计及二聚体、茎环错配分析，在UGT1A1*28(-53TA6＞TA7)和UGT1A1*6(211G＞A)多态性位点设计特异性Taqman MGB探针，两端设计引物。所有引物及探针均由上海生工生物工程股份有限公司合成。在经过预实验筛选后，综合产物片段长度和位点包含情况，选取了扩增效果最佳的引物以及探针。

作者: lvdou2000 时间: 2023-5-2 18:09

基因

名称       序列（5’→3’）                                     产物
UGT1A1*6 上游       TCTTTCACATCCTCCCTTTGG          91bp
                  下游       TAGCACCTGACGCCTCGTT
                  G探针    FAM-AATGCTCCGTCTCTGA-MGB
                  A探针       VIM-ATGCTCTGTCTCTGAT-MGB
UGT1A1*28 上游    CCTGCTACCTTTGTGGACTGAC    132bp
                  下游       CTTTGCTCCTGCCAGAGGTT
               TA7探针 FAM-TGCCATATATATATATATATAAGTAGGA-MGB
               TA6探针 VIC-TTGCCATATATATATATATAAGTAGGA-MGB
根据其样本DNA的浓度进行稀释至10μM，采用宝日医(TaKaRa)生物技术公司(货号：RR390A)中PCRMIX及ROX作为基本原料，来配制UGT1A1*28和UGT1A1*6两个反应体系。
   Taqman探针法PCR反应体系
试剂                                                       使用量
Premix Ex Tq                                                 10μl
引物（10 μM）                                              0.3μl
FAM探针/VIC探针                                        0.6/0.2μl
ROX Reference Dye II(50×)                            0.2μl
灭菌水                                                             3.4μl
DNA模板（10 μM）                                        5μl

作者: lvdou2000 时间: 2023-5-5 15:10

      基因

名称       序列（5’→3’）                               产物
UGT1A1*6 上游       TCTTTCACATCCTCCCTTTGG       91bp
                  下游       TAGCACCTGACGCCTCGTT
                  G探针    FAM-AATGCTCCGTCTCTGA-MGB
                  A探针       VIM-ATGCTCTGTCTCTGAT-MGB
UGT1A1*28 上游       CCTGCTACCTTTGTGGACTGAC
132bp
                     下游       CTTTGCTCCTGCCAGAGGTT
                  TA7探针 FAM-TGCCATATATATATATATATAAGTAGGA-MGB
               TA6探针 VIC-TTGCCATATATATATATATAAGTAGGA-MGB
根据其样本DNA的浓度进行稀释至10μM，采用宝日医(TaKaRa)生物技术公司(货号：RR390A)中PCRMIX及ROX作为基本原料，来配制UGT1A1*28和UGT1A1*6两个反应体系。
Taqman探针法PCR反应体系
试剂                                        使用量
Premix Ex Tq                                  10μl
引物（10 μM）                               0.3μl
FAM探针/VIC探针                         0.6/0.2μl
ROX Reference Dye II(50×)             0.2μl
灭菌水                                              3.4μl
DNA模板（10 μM）                            5μl

60℃ 1min，95℃预变性1min；95℃5s，62℃ 34s，共45个循环；60℃ 1min，在60℃时收集FAM和VIC荧光信号进行检测。

作者: lvdou2000 时间: 2023-9-18 18:55

结果判读前需要确定UGT1A1*28和UGT1A1*6的纯合野生型、杂合突变型及纯合突变型的阳性对照品的有效性。根据荧光PCR软件自动分析生成的结果，进行检测结果判断，具体方法如下：方法① Taqman探针法检测采用双色荧光，根据散点图对应样本的位置，对基因直接判读分型。方法②根据扩增曲线图进行基因型的判断。当等位基因为纯合子时，表现为一条扩增曲线，并根据其荧光信号类型判读具体基因型；而等位基因为杂合子时，表现为两条扩增曲线。

      Taqman探针法扩增曲线图及散点图判读标准
SNP位点扩增曲线图    等位基因散点图    结果
UGT1A1*6 FAM单峰       G/G区域       G/G纯合野生型
      VIC单峰          A/A区域          A/A纯合突变型
   FAM/VIC双峰       G/A区域       G/A杂合突变型
UGT1A1*28 FAM单峰       7/7区域       TA7/7纯合突变型
      VIC单峰          6/6区域          TA6/6纯合野生型
      FAM/VIC双峰       6/7区域       TA6/7杂合突变型

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