中华病理技术论坛 - Powered by Discuz! Board

标题: 关于电镜标本取材问题 [打印本页]

作者: fzxd888 时间: 2006-12-20 21:38 标题: 关于电镜标本取材问题

电镜取材的要求,我在超薄切片技术中已经提到,但是,有些具体的脏器取材,可以有不同的取材方法.我经常要求研究生们采用主动脉灌注固定方法或者局部灌注法，这种固定方法最好。
   但是,由于此种方法操作比较复杂而难以实施.可是,有些研究者研究的脏器比较多如心肝肺肾脑胃肠等,如果不采取灌注固定,想将各个脏器取材都符合要求是很难的,由此而造成因取材失误导致观察失败是非常令人痛心的事情.我已经遇到过好几批标本，这些标本取材共同之处是动物彻底放血致死后取材的，缺血缺氧改变非常严重，无法作出电镜观察分析。
   为了避免各脏器长时间缺血缺氧现象,可以在动物麻醉下行各脏器主要血供血管结扎,利用扎一个取一个的方法（注意的是千万不能将整个脏器取下，最好切取一部分）,其他未取材的脏器可以保持血流,心脏,中枢神经,肺在最后取材.还有的动物可能需要采血,如有可能,应在采血前取材,如果确实有困难,只好各实验组中专门取几只动物作为电镜观察.
   以上方法仅供参考.请大家多提宝贵建议或经验，以便大家共同提高标本质量。

[ 本帖最后由 fzxd888 于 2008-4-5 12:42 编辑 ]

作者: zrz904 时间: 2006-12-21 13:33 标题: 非常感谢班长的敬业，这个版本我很喜欢

我觉的要做就应该这样，从基础普及加讨论。如果没有普及一味问是没意思的，我会来看看

作者: fzxd888 时间: 2007-1-4 16:37 标题: 透射电镜样品取材方法及要求

透射电镜样品取材方法及要求简介如下：
（一）
组织和器官取材方法：

事先准备好所需的器械和固定液，并把它放4℃冰箱内预冷备用。如为穿刺物（肾组织、肝组织、脾组织等）、剪取物（胃镜剪取物、支气管镜剪取物、肠镜剪取物等）、手术切除物（肿瘤组织以及实验动物脏器等），均应在离体后迅速用生理盐水冲洗后或直接投入预冷的2.5%戊二醛固定液（保质期为1个月）内，并把它放4℃冰箱内保存，一般要求在两分钟内完成。在处理手术切除物时，应事先准备好两把锋利的刀片（如剃须刀或手术刀）和蜡板，把固定液滴在蜡板上，再把切下来的脏器用手术刀切成小块，放在蜡板上的固定液中，接着用双刀片拉锯法（具体做法请向我室工作人员咨询）在固定液中将组织切成约1立方毫米大小或横切面约1平方毫米的长条形，然后用牙签或镊子（轻轻夹住，禁止挤压）把组织移入装有固定液的小瓶内，用医用胶布封好并做好标记。如为肺组织，应在固定液中充分震荡，使其完全沉到瓶底为止。
（二）
游离细胞取材法：
组织培养和游离细胞（如血细胞、脱落细胞以及细菌病毒等），常悬浮分散在介质中，首先必须将其凝集成团，然后进行固定，具体做法如下：
1、
血浆凝集法：将抗凝全血离心分层（2000转/每分钟，10—20分钟），用毛细吸管沿着管壁轻轻的将上清夜吸取（不要破坏白细胞层），接着用吸管吸取固定液，并沿着管壁将2.5%戊二醛固定液慢慢地加入进行固定，然后把它放在4℃冰箱内保存。
2、
血浆（血清）混合法：如为细菌、病毒、脱落细胞、培养细胞则先将它们制成悬液放置于离心管内（最好是玻璃的），离心成团（1000～3000转/分钟，10分钟，下同），去上清液后加入2.5%戊二醛固定10分钟左右，离心，再弃去多余的固定液，然后和少量抗凝血浆或血清混合均匀，离心成团，去上清液（留少许），用吸管吸取2.5%戊二醛固定液沿着离心管壁缓慢滴入，尽量避免团块分散，静置于4℃冰箱内保存备用。
二
取材要求
电镜生物样品制备的关键在于制出的样品必须忠实地反映其生活时的状态，尽量避免“死后改变”和人为假象的发生，因此，取材这一步非常重要。取材要求如下：
  1、冷：取材的器械和固定液均应事先在4℃冰箱内预冷。

2、快：取材时动作要快，所用的刀片要锋利，一般要求在脏器离体后1—2分钟内取材完毕并放入2.5%戊二醛固定液内于4℃冰箱内保存。另外，应避免对组织的挤压和人为损伤。

3、小：为了能让组织充分固定，必须把组织切成尽可能小的块，一般要求组织块在1立方毫米左右或横切面为1平方毫米的长条形,长度一般不超过3毫米，而皮肤、肌腱等组织较致密，取材应在1立方毫米以内。
  4、准：由于电镜标本要求小块取材，为了电镜观察的准确性，取材部位必须要准确，而且，不同实验组的标本尽量取在相同部位（如心肌组织取左心室，则一律取左心室），否则，将无法比较，进而影响观察结果，最终导致电镜观察失败。

      以上方法仅供参考。

[ 本帖最后由 fzxd888 于 2008-6-10 09:35 编辑 ]

作者: sjingx 时间: 2007-1-5 13:34

支持！热切期盼中。。。。。

作者: fzxd888 时间: 2007-1-29 13:13 标题: 脑组织取材法

在一般情况下，脑组织先进行灌注固定（4%多聚甲醛溶液），待固定完成后应马上打开颅骨，暴露出所要取材的位置，根据取材的要求以及实验目的割取相应的部位，如研究脑神经轴索、髓鞘以及神经胶质细胞，建议取材于脑组织白质部分，此处有髓神经纤维相对较多，胶质细胞比较丰富；如要研究神经元以及血脑屏障结构，建议取材于脑皮质的灰质部分，而且最好做定向包埋，以神经元长轴方向（大约为脑组织的矢状面）作为切面方向，这样可以很好地观察神经元细胞核、轴突以及树突结构的变化，突触以及毛细血管的结构也比较容易见到。
以上方法仅供参考，如有更好的方法，请不吝赐教。

作者: fzxd888 时间: 2007-3-11 15:46 标题: 睾丸及附睾组织取材方法

由于睾丸组织比较松软，固定难度较大，目前大多采取灌注固定法进行固定，但此方法如果处理不当，很可能会造成固定不良，原因是睾丸的血供离心脏比较远，固定液难以到达，睾丸曲细精管基膜比较厚，固定液难以渗透，导致固定不良。从兄弟院校电镜室了解到，我们还可以采用注射固定法即用注射针直接插入睾丸内部，从多个方向进行注射固定液，然后割取观察部位进行进一步浸泡固定；另外一种方法就是直接割取观察部位进行浸泡固定，需要注意的是，取材的睾丸组织必须切的很细，让固定液直接渗透入曲细精管的断面，这样，各层生殖细胞都会得到很好的固定，不过比较麻烦的就是每次操作后都要离心处理。
另外需要注意的是，要观察生精细胞，必须取材于睾丸的睾丸网部位，如果取材于直精小管部位，就看不到生精细胞了，切切注意！大鼠与小鼠的睾丸网比较表浅，就在白膜下附近。如果要观察成熟精子，最好取材于附睾的尾部，此处精子已基本成熟，而且精子密度最高。

作者: fzxd888 时间: 2007-6-27 12:55 标题: 肺组织取材法

大家一定会觉得肺组织取材比较困难，因为肺组织内部气体无法彻底排放而导致组织悬浮于固定液表面，使得固定液不能及时渗透进组织内部而导致大部分组织固定不良或无法固定。目前提倡的还是主动脉灌注固定。如果条件不成熟，只能采取浸泡固定。组织取出后尽量切得小，同时利用震荡的方法将组织沉入固定液中，还有一种方法就是将组织放在载玻片上，并将固定液滴在其上，用另外一片载玻片轻轻压在上面并轻轻挤压，一压一松，可以看到固定液内有小气泡溢出，直到小气泡消失为止，但必须注意力度不能太大，否则，组织的细胞将会被破坏。
需要注意的是，在固定之前，取材者必须清楚自己的研究目的，从而采取相应部位进行取材。如果以研究支气管黏膜为主的（这里指肺内的支气管），尽量取材于靠近肺门部位，这里有具有软骨的大支气管，在肺叶的内侧1/2部分，有小支气管、细支气管以及终末细支气管；如果主要研究肺泡上皮细胞、终末细支气管、呼吸性细支气管以及肺泡隔的结构等，建议取材于肺叶靠近胸膜一侧或者肺尖部；如果研究肺动脉内皮或壁的结构，建议取材于肺门附近的肺叶组织，这里的大小动脉数量比较多，而远侧肺呼吸部的动脉极少。

作者: fzxd888 时间: 2007-9-12 16:03 标题: 肾组织取材法

肾外包被一层薄膜，主要由纤维组织和少量平滑肌组成。一般肾标本取材部位在肾实质，实质由皮质与髓质两部分组成，一般取材部位在肾皮质，皮质位于肾的外周，其厚度因动物种类不同而有差异，一般在1mm—4mm。肾组织除了采取灌注固定外，直接浸泡固定的效果也是比较满意。肾组织取材相对比较简单，一般临床上均采用穿刺术，然后根据需要切取皮质或髓质进行观察。动物肾组织取材要注意的是，一要取材位置选择在肾的上极，二要准确判定皮质与髓质的位置，如果是皮质部位，只要将包膜分离后，将肾最外层组织取下来即可，这里一般都会有肾小球存在。

作者: fzxd888 时间: 2008-4-3 15:02 标题: 动脉取材法

动脉遍布全身，直径大小不同，一般小动脉（直径小于１mm）切成长约2mm短柱状即可．如果是大动脉，可以将动脉剖开，沿着纵轴将动脉壁切成约长2mm宽１mm的长条形．注意，在取材时尽量使用锋利的刀片（最好用剃须刀），且不要挤压血管，由于血管内皮比较脆弱，容易受伤脱落．包埋时应作好定向包埋．

作者: fzxd888 时间: 2008-4-5 13:06 标题: 骨组织取材法

骨组织分布广，有的较硬，有的较软，骨组织因为无机物沉积较多（主要为钙盐的沉积）而较硬，必须经过脱钙处理（软骨组织可以不用脱钙）。
首先将骨组织切取一小片，大概1-2毫米大小，经过4%戊二醛固定2小时以上，再经生理盐水漂洗后放入脱钙液内进行脱钙，一般选择温和的EDTA脱钙液（具体配方可参考相关资料，这里不详细叙述）进行脱钙，也可利用酸类进行脱钙，脱钙时间视脱钙液不同而有差异，至于判断脱钙程度如何，可以使用镊子夹住骨片，轻轻将两端向中心压拢，感觉其弹性强度进而判断脱钙程度。脱钙完成后先经生理盐水漂洗后再用4%戊二醛固定2小时，然后按常规方法进行处理。
如有其他好方法请不吝赐教。

作者: sunyl 时间: 2008-5-2 23:17 标题: 皮肤中朗格汉斯细胞如何染色

皮肤中朗格汉斯细胞如何染色？请高手指教，不胜感激

作者: fzxd888 时间: 2008-9-5 11:22

皮肤中朗格汉斯细胞在电镜下可以识别出来,一般不需要特殊染色.

作者: fzxd888 时间: 2009-11-23 14:33 标题: 胰腺组织取材法

胰腺为混合性分泌腺体，由外分泌腺体和内分泌腺体两部分组成。所以胰腺主要有外分泌和内分泌两大功能。胰液中的无机物主要是水和碳酸氢盐。碳酸氢盐是由胰腺小导管管壁细胞所分泌，其主要作用是中和进入十二指肠的胃酸，为小肠内多种消化酶的活动提供最适宜的碱性环境，并保护肠粘膜免受酸的侵蚀。胰液中的有机物主要是消化三种营养物质的消化酶，它们是由腺泡细胞分泌的。主要有胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶原和糜蛋白酶原。
取材的部位选择主要是根据研究的内容进行的，如果研究胰岛的分泌状态，建议取材于胰腺的尾部，而在胰腺的头部和体部则主要是导管和腺泡结构，是胰液分泌功能研究的主要部位。
取材方法一般为活体组织取材，建议取材动作要快，固定及时，如果取材时间较长，其细胞内的分泌颗粒容易破损导致其内各种消化酶渗出而引起细胞自身消化，影响细胞结构的观察结果。

作者: fzxd888 时间: 2009-11-23 14:45 标题: 脾脏的取材方法

脾脏动物体内最大的淋巴器官。位于左上腹胃的背面，胃与膈之间，呈内侧向内凹陷的扁椭圆形或条索状等，是有被膜覆盖的实体性器官，脾一侧有一凹陷，即脾门。血管、神经由此进出脾脏。被膜结缔组织从四周向脾内部伸入，形成许多条索状的小梁。小梁相互连接构成支架，支架之间为脾的实质部分。脾分为红髓与白髓两部分，白髓主要由淋巴组织构成，红髓由条索状的淋巴组织——脾索和通连成网的血窦——脾窦构成。红髓分布于白髓周围从被膜下到小梁间广泛的区域。在与白髓交界区叫边缘区，边缘区是血液中抗原物质入脾，启动免疫反应的主要场所，又是免疫致敏细胞进入白髓和脾索红髓的通道。
取材方法一般为活体组织取材，取材部位没有特殊要求，一般取脾脏实体组织的中央部位，红髓与白髓都可以取到，具体观察部位要根据半薄切片光镜定位于红髓、白髓或边缘区进行取舍。

作者: fzxd888 时间: 2010-8-2 09:31 标题: 骨髓样本的处理

骨髓样本一般观察的是各种细胞的形态，由于其内容比较复杂，需要淋巴分散液处理，进行分层，吸取所需要观察的细胞成分进行涂片（扫描电镜）或做成细胞团块进行固定（透射电镜），然后按相关电镜常规处理方法进行处理。

作者: 新手妈妈 时间: 2011-5-1 12:17

顶！

作者: encounter 时间: 2011-5-9 23:16

学习中。。。。。

作者: 水瓶康康 时间: 2011-6-4 22:23

太好了,好好学习学习

作者: 水瓶康康 时间: 2011-6-4 22:24 标题: 太好了,好好学习学习

太好了,好好学习学习

作者: shanzhiruosu 时间: 2013-3-13 12:17

学习了！谢谢分享

作者: fzxd888 时间: 2013-10-10 14:19 标题: 结扎血管取材法

从许多研究生实验动物标本取材情况来看，都不是很理想，原因最多的是放血后取材，直接导致组织细胞因缺血缺氧后出现的细胞死后变化，线粒体、内质网等膜性结构的水肿变性较常见，干扰了观察结果，导致一些不科学的形态结果。如果想在很短的时间内进行多器官取材，目前除了全身血管灌注固定以外，还有一种方法值得大家试用，就是结扎血管取材法。就是将要取材的器官游离出来，用线或血管钳阻断血流，再将该器官切取下，迅速放入固定液中修块成1立方毫米左右的若干小块，这样取材后再进行采血操作可能是比较好的结果。如果认为这样采血效果不好，那么，在实验期间应多增加几只实验动物专做电镜用，这样可以保证电镜标本的取材。以上方法仅供参考。

作者: lijiahua 时间: 2015-9-17 16:18

认真学习了

作者: aimamala 时间: 2015-11-2 13:26 标题: 紧急求教版主培养细胞的取材！

最近要做培养细胞的透射电镜样本，经验不足，特向版主求教！
我按以下流程可行吗？步骤是否有遗漏？顺序上是否合理？
培养瓶培养的细胞取材：1、加入胰蛋白酶消化液，让附壁细胞脱壁；2、将细胞悬混液装入玻璃试管，3000转/分，离心10分钟；3、弃去上清液，加入4摄氏度2.5%戊二醛，固定30分钟；3、弃去固定液，加入缓冲液漂洗5分钟，3000转/分，离心10分钟，弃上清，反复3次；4、加入小牛血清，混匀，3000转/分，离心10分钟，弃上清；5、加入2.5%戊二醛，固定1小时。
是否应该在第2步时就加入戊二醛比较好呢？因为离心10分钟，我担心细胞会有形态改变。

作者: fzxd888 时间: 2015-11-4 16:59 标题: 关于培养细胞的前固定

培养细胞的固定在胰酶消化后先用生理盐水做成悬液，然后离心沉淀，弃上清液后加入戊二醛固定液，然后用吸管吹气打碎细胞团，让细胞固定充分（30分钟-60分钟），然后离心成团，如果细胞团大于2mm，建议用刀片切成2份，分管固定。用血清作为预包埋细胞团，最好将细胞团游离于血清液中15分钟后吸取血清，要留一点血清，然后加入固定液于冰箱内固定过夜即可。在后续处理中应保证细胞团不分散，如果不能成团，只能每一步都要进行离心沉淀处理。以上建议，仅供参考。

作者: aimamala 时间: 2015-11-5 10:52

谢谢版主的指点！有人说胰酶消化后的细胞就变圆了，形态不好
可以把培养液倒掉，PBS液涮洗三次后，加入固定液固定30分钟，然后刮取细胞，离心沉淀，加PBS液清洗2次，后加入血清混匀离心，再次加入固定液，大的团块改小即可。
这样细胞形态更好，是否是这样呢？内心很矛盾！请指点！

作者: lijiahua 时间: 2015-11-12 15:20

分享了，

作者: fzxd888 时间: 2016-10-10 13:05 标题: 培养细胞的取材探讨

细胞培养是实验最基础的实验手段，如何制好细胞包埋块，却不是一件容易的事情，现在介绍一种方法，大家试试。
一、透射电镜处理：1、培养瓶内细胞培养的，先将培养液倒掉，用生理盐水或缓冲液漂洗一次，然后将固定液倒入培养瓶内将细胞全部浸入固定液内约半小时，然后用胰酶消化处理，将消化下来的细胞离心成团，根据血清预包埋法进行处理即可。2、载玻片培养的（光滑面），将玻片用生理盐水漂洗干净后，用刀片沿着玻片边缘切割出矩形细胞片，再用固定液浸泡30分钟，然后在冷的生理盐水中摇换，使细胞片自然脱落，如果不能自然脱落，可用镊子及刀片协助剥离。这种处理方式可很好地观察细胞间的连接情况。然后按常规方法处理。
2、扫描电镜处理：1、培养瓶内细胞培养的，用生理盐水或缓冲液漂洗一次，然后将固定液倒入培养瓶内将细胞全部浸入固定液内约半小时，然后用胰酶消化处理，将消化下来的细胞离心成团，然后常规处理，但这种处理方法容易将细胞表面结构造成破坏。2、破坏性处理：先用生理盐水漂洗后将玻璃培养瓶打碎，取出1-2厘米大小的碎片（有细胞）浸入固定液内固定30分钟，进行常规操作处理，用冷冻干燥法干燥。3、盖玻片（1cm）细胞培养:将细胞直接培养在盖玻片上，清洗干净后按常规方法处理即可，冷冻干燥法干燥。载玻片培养的应该将玻片切割成1cm大小进行处理。这种处理方法可以很好地保存细胞的培养时的形态。以上方法，仅供参考！

[ 本帖最后由 fzxd888 于 2017-11-23 10:54 编辑 ]

作者: fzxd888 时间: 2017-4-26 10:00 标题: 取材问题补充

从目前的情况来看，电镜标本取材还没有一个规范性操作标准，由于科研项目的要求不同，取材方式会有些许差异。但是电镜取材与光镜取材有着明显不同之处，由于电镜观察的局限性以及很高的一致性-即标本经过固定后与生活时的状态要非常接近，需要在尽可能短的时间内标本得到固定，因此，电镜取材才会有“快、小、冷、准”的要求。但是，很多学生对这个要求理解不透，取材失误也就在所难免了。有些学生担心取不到需要观察的位置，因此就取得较大一块标本，最终导致标本固定不良失去了观察意义，费时费力却得不到结果，白忙活！因此，任何生物标本必须严格按照上述四个要点进行，如果真的做不到“快”，但至少要做到“小”，小是最关键的要求，即标本的大小要小于1毫米，在保证取材部位准确的前提下尽可能的“小”，标本数量尽可能多些，这样就可保证标本的完整性。因为每个包埋块都要先进行半薄切片观察，总会找到需要观察分析的位置。其实那些取得较大块的标本只要多切几刀，分成若干个小块即可，其实这个操作并不难！这也说明大多数学生对取材和结果相关性的认识不够，对取材的重要性没有引起足够的重视有关！

作者: 黑龙江羔羊 时间: 2018-5-9 09:02

谢谢

作者: fzxd888 时间: 2020-6-30 09:46 标题: 关于培养细胞取材之原位固定问题

细胞培养是一个细活，条件苛刻，需要一丝不苟的态度和深厚的技术积累。由于影响培养细胞的固定质量的因素较多，应该引起大家的注意，比如PH值、渗透压、浓度以及配方溶剂性质等，其中固定液PH值的影响常常被忽略了，我们知道，大多数细胞属于PH值7.0范畴，但有些细胞适合酸性环境比如胃、小肠上皮细胞，肾组织偏酸性，则固定液也应该调整相应PH值。有些细胞适合于高渗环境，比如海洋生物细胞，有些适合于低渗环境，比如淡水生物细胞，故固定液也需要相应调整！我们常规的戊二醛固定液PH值大概在6.8-7.2之间，适合于大多数细胞。对于培养细胞，固定液的浓度可以稍降低一些，比如1.5%。大家可以根据细胞培养液的相关指标对固定液作相应调整。对于贴壁培养细胞来说，最佳方法就是在载玻片上培养-原位常温固定-低温轻推刮取-离心沉淀-血清（蛋清）预包埋预固定。目前不提倡胰酶消化作常规电镜观察！

作者: fzxd888 时间: 2020-10-10 16:00

目前有些同学在实验动物取材外周神经的时候，采取分离后镊子挑出再剪刀剪断，这样做出来的标本，其神经髓鞘由于拉伸损伤造成髓鞘假性松解水肿现象，应该引起大家注意。正确的做法是，在原位将神经纤维连同周围组织一起剪下，再进一步修剪处理，必须用“双刀切割法”修块，长度保证小于等于1mm左右。

作者: fzxd888 时间: 2020-10-10 16:22 标题: 回复 24# 的帖子

从目前的观察效果来看，培养细胞最好是原位固定后再行后续处理。由于胰酶消化下来的细胞，好多存在细胞膜损伤情况，对于超微结构研究影响较大，尤其是细胞器大部分受到影响，实验结果偏差较大！对于不重视超微结构而仅仅是观察某些纳米材料是否进入细胞内及存在部位的观察，胰酶消化可以接收。正确的方法就是：在培养细胞（贴壁细胞）时，将细胞培养在载玻片上，再将培养好的细胞的载玻片浸没在固定液內原位固定20min左右，再将载玻片浸没在冷的缓冲液中稍微冷却后，让细胞因冷刺激稍微收缩，与载玻片接触面粘附度减少，便于剥离（尤其是连接紧密上皮细胞），技术好的话，可以整片剥离下来，如果实在剥不下来，可以用锋利刀片协助刮下，这样的细胞大多保持原样，可以很好地区分细胞的游离面和基底面，以及细胞间的连接状况，而且细胞完整度很高，大家可以试试。

欢迎光临中华病理技术论坛 (http://bbs.zhbljs.com/bbs/)