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标题: CD4 ,CD8 免疫组化 [打印本页]

作者: fengshm96 时间: 2007-7-24 10:57 标题: CD4 ,CD8 免疫组化

最近在做冰冻切片的CD4,CD8免疫荧光，采用了脾脏冰冻切片作为阳性对照，可是在作预实验时阳性也染不出来，我的操作如下
1、小鼠灌流，PFA固定，蔗糖脱水，oct包埋，液氮速冻，切片厚度10μm
2、切片以PBS洗涤3次，0.3%过氧化氢处理10min（本来我的免疫荧光从理论上说不需要这一步，可是我在以往做脑片的染色时发现经过这一步才能得到结果，很奇怪！），PBS洗涤3次，抗原热修复10min，自然冷却，PBS洗涤3次
3、10%羊血清溶于3%triton中封闭并透膜30min，不洗，直接甩去液体，再擦干周围水分，加入梯度稀释的一抗（ebioscience）1:100，1:200，1:400，1:500。4℃过夜
4、PBS洗涤3次，加入二抗1:100（进口分装immunoresearch）37℃1h，PBS洗涤3次
5、hoechst33258染核，PBS洗涤3次，荧光显微镜观察
结果很奇怪，灌流后其他组织都变白了，可是脾脏仍然是褐红色；
染色结果切片过厚，细胞有重叠，不便于观察；
另外组织有自发荧光，自发荧光呈环状，环内细胞无自发荧光，但也不阳染，很发愁，请大家指教！非常感谢！

另我的抗体是ebioscience的，14-0042 affinity purified anti－mouse CD4(L3T4)
14-0081 affinity purified rat anti－mouse CD8(CD8a)

应用里可用于IH/F

作者: shanghainese 时间: 2007-7-24 11:12

这两可抗体不能用于福尔马林固定的组织细胞.

作者: fengshm96 时间: 2007-7-24 11:27

那么我的PFA固定也不行吗？

作者: shanghainese 时间: 2007-7-24 11:34

引用:

原帖由 fengshm96 于 2007-7-24 11:27 发表
那么我的PFA固定也不行吗？

里面含有福尔马林吗?

作者: fengshm96 时间: 2007-7-24 11:35

我怎么在说明书上没看到关于可不可以用于福尔马林固定组织的描述呢？请问我在选择抗体时该如何判断是否可用于PFA固定呢？

作者: shanghainese 时间: 2007-7-24 11:40

引用:

原帖由 fengshm96 于 2007-7-24 11:35 发表
我怎么在说明书上没看到关于可不可以用于福尔马林固定组织的描述呢？请问我在选择抗体时该如何判断是否可用于PFA固定呢？

第一个问题, 您应该问 ebioscienc 为何没有关于可不可以用于福尔马林固定组织的描述呢？

第二个问题, 大公司的说明书上有比较详细的说明.你多找找.

作者: fengshm96 时间: 2007-7-24 13:48

引用:

原帖由 shanghainese 于 2007-7-24 11:34 发表

里面含有福尔马林吗?

PFA是多聚甲醛，sigma的产品，直接配的，我不知道这里面有没有福尔马林，应该没有吧！

作者: shanghainese 时间: 2007-7-24 22:36

引用:

原帖由 fengshm96 于 2007-7-24 13:48 发表

PFA是多聚甲醛，sigma的产品，直接配的，我不知道这里面有没有福尔马林，应该没有吧！

不及格。

作者: fengshm96 时间: 2007-7-25 09:22

斑竹请明示，我真的对这个问题不是很清楚啊！而且我现在查到ebioscience的这个抗体却是不适于在福尔马林固定的组织细胞上做，我很郁闷！那我的PFA也应该算含福尔马林的吗？

作者: shanghainese 时间: 2007-7-25 10:30

引用:

原帖由 fengshm96 于 2007-7-25 09:22 发表
斑竹请明示，我真的对这个问题不是很清楚啊！而且我现在查到ebioscience的这个抗体却是不适于在福尔马林固定的组织细胞上做，我很郁闷！那我的PFA也应该算含福尔马林的吗？

福尔马林是37%甲醛水溶液的商品名称.
多聚甲醛是固态的甲醛多聚体. 多聚甲醛溶解在水里,就成了甲醛水溶液.其性质与福尔马林就一模一样了.
你的PFA固定液里当然含有"福尔马林".

作者: fengshm96 时间: 2007-8-1 20:07

多谢斑主！请问您知道哪有可用于PFA固定样本的抗小鼠CD4,CD8抗体吗？我找了很多都没找到，人的很多，小鼠的比较少见！

作者: shanghainese 时间: 2007-8-2 02:14

http://www.jhc.org/cgi/reprint/43/3/313.pdf

作者: iamyueyueyue 时间: 2007-8-2 09:49

我打不开这个网址

作者: shanghainese 时间: 2007-8-2 10:55

Immunohistochemical Detection of T-cell Subsets and Other Leukocytes in Paraffin-embedded Rat and MouseTissues with
Monoclonal Antibodies
The Journal of of Histochemistry and Cytochemistry Vol. 43, No. 3, pp. 313-320, 1995

作者: fengshm96 时间: 2007-8-2 13:10

斑主，我查了很多公司的protocol，发现多数都是用丙酮来固定冰冻切片的，反而之前我认为普遍使用的PFA比较少见，而且这些公司也都没提到是否可用PFA固定，所以我很疑惑，这两种固定剂的使用会对抗原蛋白的表达起到什么影响呢？对于后者及PFA固定的样本，经过合适的抗原修复，能否使那些用于丙酮固定样本的抗体显色呢？非常感谢！

作者: fengshm96 时间: 2007-8-3 11:08

我的切片都已经做好，都是用PFA预固定的，现在买不到合适用于PFA固定样本的CD4,CD8抗体，该怎么办呀！求助！

作者: shanghainese 时间: 2007-8-3 12:45

引用:

原帖由 fengshm96 于 2007-8-2 13:10 发表
斑主，我查了很多公司的protocol，发现多数都是用丙酮来固定冰冻切片的，反而之前我认为普遍使用的PFA比较少见，而且这些公司也都没提到是否可用PFA固定，所以我很疑惑，这两种固定剂的使用会对抗原蛋白的表达起到什么影响呢？对于后者及PFA固定的样本，经过合适的抗原修复，能否使那些用于丙酮固定样本的抗体显色呢？非常感谢！

不可能.
因为许多许多年前就已经这样试过了.

作者: shanghainese 时间: 2007-8-3 12:46

引用:

原帖由 fengshm96 于 2007-8-3 11:08 发表
我的切片都已经做好，都是用PFA预固定的，现在买不到合适用于PFA固定样本的CD4,CD8抗体，该怎么办呀！求助！

换别的抗体.

作者: fengshm96 时间: 2007-8-3 13:17

换抗体？那我的实验方案就得改了！好郁闷！

作者: hot2113 时间: 2010-3-7 10:33

请问下，版主。
我也想做CD4，CD8的大鼠肝免疫组化。现在我也已经做成了石蜡块，肝组织之前也是用甲醛固定的。
我听你这样一说，有点害怕~！！！

作者: hot2113 时间: 2010-3-7 10:34

什么可以做，什么不可以做，哪里有没有这些资料

作者: colin 时间: 2010-4-6 17:42

引用:

原帖由 shanghainese 于 2007-7-24 11:12 发表
这两可抗体不能用于福尔马林固定的组织细胞.

中性甲醛固定后作的CD4、CD8效果还不错的！

作者: encounter 时间: 2011-5-9 23:36

同样学习

作者: brian627 时间: 2013-5-6 20:55

非常好，谢谢

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