请各位老师帮忙，本人现要做神经标本的hoechst核染色，

步骤如下：1、4%的多聚甲醛固定24h；

             2、20%的蔗糖浸泡24h；

             3、30%的蔗糖浸泡24h；

                  4、10微米冰冻切片机切片；

               5、0.01 M PBS 3次/5min；

                                   6、hoechst   1:100稀释避光染色30min;

                 7、0.01 M PBS  3次/5min；

           8、荧光显微镜下观察。

                                                 现在遇到的问题是经多次实验染色，荧光显微镜下都没有看到有染上色的荧光，不知道上述步骤                                                是否有错误；请教各位老师染不上色还有哪些原因，现在实验做了好多次都没有成功，心里着急啊，多谢各位高手指点！