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标题: 骨组织免疫组化求助 [打印本页]

作者: wandongdong 时间: 2009-1-2 15:58 标题: 骨组织免疫组化求助

本人刚做免疫组化，做的是兔骨（痂）组织的TGF，但目前存在严重掉片问题，试做了8张片子，中途就脱完了一张，退出染色，最后又完全脱掉了2张，成为白片，最终得到5张片子，组织已经少的可怜，染色背景一片黄染，应该就是所说的非特异性染色吧。整个染色过程按照说明书上进行。抗原修复使用热水煮沸，在修复液中修复。请问这些问题是什么原因，怎么解决？（载玻片事先用肥皂水洗、酸+重铬酸钾浸泡过夜，蒸馏水洗，酒精浸泡过夜，绸布擦干，后多聚赖氨酸涂胶。）望各位组化高手给予指点迷津，并能上传该生长因子阳性染色的图片。谢谢，感激不尽。
我买的博士得的试剂，按照SABC法进行的，大致步骤如下：
1)脱蜡、水化。
二甲苯I[15-25分钟]、二甲苯II【10-15分钟】
滴度酒精水化各5分钟
2蒸馏水浸洗两次2-3分钟。
3)用蒸馏水配置新鲜的3%H2O2，室温封闭10-20分钟，蒸馏水浸洗3次。（此时已经开始出现脱片。）
4)抗原修复（切片置于盛柠檬酸液的容器中，并放置水中煮沸后关闭电源，5-10分钟后再次煮沸断电，重复1-2次）。后将容器连同切片取出放置室温冷却.
5)PBS洗2分钟2-3次。
6)滴加封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。PBS浸洗2分钟2-3次。
7)滴加Ⅰ抗, 4℃过夜
8)PBS洗三次每次3分钟。
9)滴加二抗, 37℃10-20分钟。
10)PBC洗3次每次3分钟。
11)滴加试剂SABC， 37℃10-20分钟。
12)PBS洗4次每次5分钟。
13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
14)蒸馏水洗。苏木素复染5分钟、盐酸酒精分化、氨水反蓝
15)脱水、透明、封片、镜检。
整个石蜡标本及切片为我们医院的一个很有经验的主任技师制作。切片厚度为4微米。制作后HE染色效果尚可。现在最头疼为掉片问题太严重，也问过其他做骨组织的师兄，都说软组织掉片都有限度的，骨组织掉片国内外都没有好方法，能在我做的过程中找找原因，给给经验吗？最后的组织都掉的差不多了，没有可采集的图片上传，等等做做下批我再上传让你看看是否为非特异染色。急切希望给予答复，在此叩谢！
补充一下，我的组织展片捞片后即在70度烤箱中过夜了，整个染色操作过程也非常轻柔，清洗都是用浸泡。

作者: shanghainese 时间: 2009-1-3 13:28

骨组织切片本身就容易掉片。
您可以试一下Superfrost Plus 防脱载玻片。

作者: HollowHills 时间: 2009-4-9 16:20

烤片65度2小时以上可以有效防止脱片，但还是经不起水煮的
抗原修复按抗体说明书进行，不一定要煮的

作者: 黄树叶 时间: 2009-5-11 14:26

一、片子能不能再薄点？
二、挂胶是否到位了，其他的掉吗？
三、考片温度时间长，太高了也会烤焦的，你试试60度过夜？
四、在高压修复锅中放一不锈钢架，意思是不让沸腾的水直接冲击到组织上？

你再想想其他好的办法，我相信问题一定能够解决的。

作者: lijie208239 时间: 2009-5-30 21:03

骨头难啃呀

但是我给你说个方法但是别的别这样用你可以不修复尝试下但是一定要做阳性对照固定选择恰当的固定液同时找个技术过硬的技术员帮你切片一个优质的切片对后期处理是很有好处的祝你成功

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