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电子显微镜的新技术及研究进展

本主题由 dingwei 于 2018-11-15 12:49 提升

电子显微镜的新技术及研究进展

随着电镜技术的不断发展以及生命科学研究的深入,对于细胞器以及蛋白大分子的三维结构的研究越来越引起大家的重视和探索!目前较常规的技术有样品倾斜电子断层技术、连续切片扫描技术、单颗粒冷冻技术等。
1、样品倾斜电子断层成像技术:是通过透射电镜获取同一区域多个角度的投影图来反向重构所研究对象的三维结构, 适合于在纳米级尺度上研究不具有结构均一性的蛋白、 病毒、 细胞器以及它们之间组成的 复合体的三维结构。 与蛋白质电子晶体学和单颗粒技术相比, 这种技术无需样品颗粒具有结构同一性,也不强调样品具有一定的对称性。 因此,虽然目前电子断层成像所获得的结构的分辨率 (约 4~10 纳米)不能与单颗粒技术相比, 但其在研究非定形、 不对称和不具均一性的生物样品的三维结构和功能中有着不可替代的重要作用,尤其是膜结构蛋白的研究。 冷冻或常规电子断层成像的适用尺度非常广泛,包括从分子水平的蛋白质, 到亚细胞水平的细胞器,以至细胞水平的组织结构(培养细胞、神经元及突触的特殊结构)。
       由于电子断层成像较适合用于研究细胞环境下的三维结构,因此,可采用常规包埋法、快速冷冻法、冷冻置换以及单颗粒冷冻技术等制备电镜样品。,多数采用超薄切片的方法进行制样, 但制样过程仍然会引起一些结构畸变,影响了样品的结构细节。对厚样品可以采用高压冷冻 ,利用高压降低水的冰点使得冷冻达到更深的层次, 随后进行冷冻置换 ,就是在低温下用有机溶剂将冷冻组织进行置换脱水, 逐渐升温后进行传统的包埋、 切片等步骤进行制样。 利用这种方法制备的样品在结构细节的保持上可以取得较好的效果。 而真正能使大细胞和组织保持天然状态的制样办法是高压冷冻并进行冷冻切片。 但冷冻切片必须配置冷冻切片机,而且切片难度大,是一项很具挑战性的工作, 目前只有少数的实验室能够达到较高的成功率。
2、连续切片扫描电镜技术:同样通过常规包埋法、高压冷冻法、冷冻置换等制作包埋块,一种是在扫描电镜外置一台超薄切片机,通过收集连续切片进行拍照,其优点是可以重复拍照,缺点是拍照对中及一致性要求难度大,往往造成切片移位,影响三维重构处理结果。另一种是内置一台超薄切片机,每切一张,拍一张照片,但不能重复拍照,对环境的振动及切片刀的要求极高,稍有振动或切片刀粘片,都会造成切面损坏,影响连续拍照的结果。
3、单颗粒冷冻技术:最近几年,冷冻电镜技术有了革命性的进步,主要得益于三个方面的突破。首先是样品制备,通过利用薄膜碳层甚至石墨烯可以用更薄的冰层包裹分子样品来提高信噪比。第二个突破是电子探测器的发明,它能够直接探测电子数量,并支持电影模式(movie mode),可以在一秒钟之内获得几十张投影图片。通过后期对样品进行漂移修正,再把这几十张图片叠加起来,从而大幅提高成像的信噪比。第三个突破是计算能力的提高和软件算法的进步。冷冻电镜的模型重构通常需要对几万甚至几十万张投影图片进行分析、组装和优化。这需要先进的计算资源配合有效的算法才能实现。基于贝叶斯理论的模型重构框架解决了这个问题,可以应用于很多以前不能解决的生物大分子的结构研究。其制样方法就是将均一性的颗粒敷在特制的铜网上,经过快速冷冻形成玻璃样薄层,能很好地保存颗粒的原貌,同时利用低剂量电子束照射,大大减少了辐射损伤,给后期的三维重构提供可靠的形态依据。
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