避免Golgi 银染标本表层产生铬银沉淀的一个方法
Golgi 镀银染色法自从问世以来一直是研究神经组织形态
学的重要手段。经典的Golgi 染色法是先将神经组织用重铬酸
钾进行铬化处理,然后浸染硝酸银[1 ] 。后来,在其基础上又衍生
出很多方法,主要分为Cox 升汞法和Bielschowsky 还原银法两
大类,丰富了神经组织的银染技术。但是,通过实践,我们认为
经典的Golgi 染色能同时清晰显示神经元和胶质细胞的整体形
态,并且操作简便,耗时短,在教学和实验筛查工作中仍然最为
实用;而后面两类改进方法分别存在处理时间过长和结果一致
性不高等缺陷。经典Golgi 银染法的美中不足在于,浸染硝酸银
的过程中,标本表层很容易产生铬银沉淀,可能干扰和阻挡我们
对神经组织浅层结构的观察。因此,我们在反复摸索的基础上,
对Golgi 染色处理过程做了改进,既能获得高质量银染图像,同
时标本表层又不产生铬银沉淀。
1 材料和方法
111 动物材料
12 周龄健康雄性SD 大鼠脑组织。
112 主要试剂
多聚甲醛(Merk) ;重铬酸钾(成都新川化学试剂公司) ;硝
酸银(成都化学试剂厂,用超纯水溶解) ;5 %火棉胶(天津大茂化
学试剂厂) ;中性树胶(上海标本模型厂) 。
113 主要仪器
隔水式恒温箱(上海一恒9160) ; 滑行切片机(Leitz2Wet2
zlar) ; 光学显微镜( Olympus BH22 ) ; 数码相机( Olympus
C5060wz) 。
114 切片和染色方法
脑标本随机分成2 组,分别按照经典和改进的Golgi 染色法
处理。经典Golgi 染色程序参照孟运莲等[1 ]的记载,改进后的染
色程序如下。
11411 取材和固定 大鼠经心灌注固定,固定液采用中性缓冲
甲醛(4 g 多聚甲醛,815 g NaCl , 011 mol/ L PB , p H 712) 。开颅
取出全脑,浸泡于相同固定液中,室温下1 周,修块。
11412 表面包被处理 将固定充分的组织在蒸馏水中漂洗数
次,共约4 h。用软吸水纸吸去多余水分,投入5 %火棉胶液中。
标本被胶液浸没后立即捞出,放在普通滤纸上使表面刚好变干,
不与镊子粘连。
11413 铬化银染 表面包被好的组织块投入3 %重铬酸钾水溶
液中,37 ℃浸泡,24 h 后换液1 次,然后继续浸泡2 d。铬化后,
取出组织块于蒸馏水中稍微漂洗一下, 不必久置, 投入少量
115 %硝酸银溶液中漂洗数分钟。转入足量115 %硝酸银溶液,
37 ℃避光浸染3 d。
11414 包埋切片 银染完成后,组织经过浓度为70 %、80 %、
90 %、95 %、100 % Ⅰ、100 % Ⅱ的各级乙醇脱水,每级停留4 h。
浸乙醇2乙醚等体积混合液24 h ,然后经1 %、2 %、4 %、5 %火
棉胶梯度浸透,每份停留1～2 d。用5 %火棉胶包埋(约1 周时
间) 。包埋块修整并用5 %火棉胶粘于木块,稍晾干后浸于70 %
乙醇。次日滑行切片机切片,片厚60μm。
11415 裱片和封片 切片可暂存于90 %乙醇。封裱时经95 %
乙醇浸泡1 min ,转入叔丁醇充分脱水5 min ,中间换液1 次。捞
起放置在洁净载玻片上,直接滴加浓中性树胶盖住整个切片(包
括组织周边的胶片;如果剪去多余胶片可节约树胶用量) 。置于
37 ℃温箱干燥过夜即可直立插入标本盒中保存。如需长年保
存,切片不能加盖玻片。
2
2 结果
显微镜观察大鼠脑距正中面219 mm 的矢状切面[2 ] 上大脑
皮质、白质和小脑皮质3 处的染色结果。改进后的Golgi 染色法
能清晰显示大脑皮质浅层的细胞(图2 ,见封底) ,而完全没有形
成经典染色程序中出现的黑色的铬银沉淀(图1 ,见封底) ;大脑
皮质其余层次的结果与原法相比未见明显差别。改进Golgi 法
与原法都能清晰显示大脑皮质神经元的树突棘(图3 , 4 ,见封
底) 。此外,改进法与原法浸染的大脑皮质内均能见到广泛分布
的原浆性星形胶质细胞(图1 , 2 ,见封底) ,白质内均能观察到形
态典型的纤维性星形胶质细胞(图5 , 6 ,见封底) 。改进的染色
程序仍然会着染血管(图2 , 6 , 8 ,见封底) 。Golgi 染色原法要在
暴露的小脑皮质染出可区分的浦肯野神经元几乎是不可能的
(图7 ,见封底) ,而改进后的方法很容易染出满意的结果(图8 ,
见封底,皮质表面的棕黑色条状物为分布于小脑表面的血管) 。
3 讨论
Golgi 染色法能显示脑神经元和大胶质细胞的整体形态,其
图像的质量、树突棘和突起侧支显示的精确性是目前其他形态
学技术难以超越的。为了弥补Golgi 银染过程中标本表面形成
过于浓厚的铬银沉淀这一缺陷,已经有人做过尝试并报道了几
个改良方法。Frot scher[3 ] 将海马薄片重叠在一起,用琼脂包裹
成块进行Golgi 染色;铬化、浸染完成后再分开裱片。这种方法
对脑其余部分的镀银染色也有借鉴意义,但需要防止琼脂溶解,
浸染过程于低温进行,时间长,染色前后处理手续复杂。Angulo
A 等[4 ]则用内外两层滤纸包裹脑组织形成“三明治”结构再进行
Golgi 染色。该方法对内外两层滤纸的孔径有要求(外大内小) ,
滤纸必须严格将组织密封,这一点需要借助额外的器材;此外,
该方法染出的神经元数目颇为稀少,是一大遗憾。本实验的改
进之处在于: (1) 将神经组织表面包裹一层火棉胶,然后用于
Golgi 银染,使原来沉积在组织表面的铬银沉淀转而沉积在火棉
胶层上;火棉胶层的铬银沉淀在100 %乙醇脱水步骤会随着火棉
胶的溶解而脱落,因此切片周边比较干净; (2) 用市售低浓度
(5 %) 火棉胶直接包埋组织,使浸透与包埋时间缩短了1 周左
右,最近已有使用5 %火棉胶包埋的报道[5 ] ,但本方法耗用的时
间更短,因为包埋后稍晾干并用70 %乙醇浸泡数小时,包埋块的
硬化程度与等待胶块多挥发数周达到的硬度差别不大,不影响
切片; (3) 在95 %乙醇脱水后,直接转入2 份叔丁醇,完成最后的
脱水,切片平整且不变形,很容易裱片和封片,本项改进对尺寸
较大的火棉胶切片尤其适用。经过以上改进后, Golgi 银染标本
表层产生铬银沉淀的问题得到了解决,同时保持了经典方法在
图像质量、结构精细程度和操作简便方面的优点。此外,改进的
Golgi 银染法对神经组织的固定没有苛刻要求,普通甲醛固定液
即可;因此可以采取灌注固定的办法,有利于动物全身标本的充
分利用。
图版说明(图见封底)
图1～8 改进的Golgi 银染法与原法结果的比较.
图1 :大脑皮质原法染色,10 ×;图2 :大脑皮质改进法染色,10 ×;图3 :原
法显示的大脑皮质神经元树突棘,100 ×;图4 :改良法显示的大脑皮质神
经元树突棘,100 ×;图5 :原法显示的大脑白质纤维性星形胶质细胞,20
×;图6 :改进法显示的大脑白质纤维性星形胶质细胞,20 ×;图7 :小脑
皮质原法浸染,20 ×;图8 :小脑皮质改进法浸染,20 ×; q :神经元; u :胶
质细胞; ▲:树突棘; 3 :大脑与小脑皮质的表面.
参考文献
[ 1 ] 孟运莲. 现代组织学与细胞学技术[M] . 武汉:武汉大学出版社,
2004 :38239.
[ 2 ] Paxinos G, Wat son C. The rat brain in stereotaxic coordinates
[M] . 4t h ed. San Diego : Academic Press , 1998 : Figure 85.
[ 3 ] Frot scher M. Application of t he Golgi/ EM technique for cell iden2
tification in immunocytochemical , ret rograde labeling , and develop2
mental studies of hippocampal neurons [ J ] . Microsc Res Techn ,
1992 ,23 (4) :3062323.
[ 4 ] Angulo A , Fernández E , Merchán J A , et al . A reliable met hod
for Golgi staining of retina and brain slices [J ] . J Neurosci Met h2
ods , 1996 ,66 (1) :55259.
[ 5 ] 张苏,陈永珍, 朱 . 改良的火棉胶切片技术[ J ] . 解剖学杂志,
2007 ,30 (2) :255 ,260.
(编辑:黄会龙)
作者：郑 翔 马玉琼 章 为
作者单位：(四川大学华西基础医学与法医学院组织胚胎学与神经生物学教研室, 成都 610041
文章转载于：解剖学杂志 2008 年第31 卷第6 期
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