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关于电镜标本取材问题

结扎血管取材法

从许多研究生实验动物标本取材情况来看,都不是很理想,原因最多的是放血后取材,直接导致组织细胞因缺血缺氧后出现的细胞死后变化,线粒体、内质网等膜性结构的水肿变性较常见,干扰了观察结果,导致一些不科学的形态结果。如果想在很短的时间内进行多器官取材,目前除了全身血管灌注固定以外,还有一种方法值得大家试用,就是结扎血管取材法。就是将要取材的器官游离出来,用线或血管钳阻断血流,再将该器官切取下,迅速放入固定液中修块成1立方毫米左右的若干小块,这样取材后再进行采血操作可能是比较好的结果。如果认为这样采血效果不好,那么,在实验期间应多增加几只实验动物专做电镜用,这样可以保证电镜标本的取材。以上方法仅供参考。
努力是根本,健康是关键
个人观点,仅供参考!

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认真学习了

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紧急求教版主培养细胞的取材!

最近要做培养细胞的透射电镜样本,经验不足,特向版主求教!
我按以下流程可行吗?步骤是否有遗漏?顺序上是否合理?
培养瓶培养的细胞取材:1、加入胰蛋白酶消化液,让附壁细胞脱壁;2、将细胞悬混液装入玻璃试管,3000转/分,离心10分钟;3、弃去上清液,加入4摄氏度2.5%戊二醛,固定30分钟;3、弃去固定液,加入缓冲液漂洗5分钟,3000转/分,离心10分钟,弃上清,反复3次;4、加入小牛血清,混匀,3000转/分,离心10分钟,弃上清;5、加入2.5%戊二醛,固定1小时。
是否应该在第2步时就加入戊二醛比较好呢?因为离心10分钟,我担心细胞会有形态改变。

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关于培养细胞的前固定

培养细胞的固定在胰酶消化后先用生理盐水做成悬液,然后离心沉淀,弃上清液后加入戊二醛固定液,然后用吸管吹气打碎细胞团,让细胞固定充分(30分钟-60分钟),然后离心成团,如果细胞团大于2mm,建议用刀片切成2份,分管固定。用血清作为预包埋细胞团,最好将细胞团游离于血清液中15分钟后吸取血清,要留一点血清,然后加入固定液于冰箱内固定过夜即可。在后续处理中应保证细胞团不分散,如果不能成团,只能每一步都要进行离心沉淀处理。以上建议,仅供参考。
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谢谢版主的指点!有人说胰酶消化后的细胞就变圆了,形态不好
可以把培养液倒掉,PBS液涮洗三次后,加入固定液固定30分钟,然后刮取细胞,离心沉淀,加PBS液清洗2次,后加入血清混匀离心,再次加入固定液,大的团块改小即可。
这样细胞形态更好,是否是这样呢?内心很矛盾!请指点!

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培养细胞的取材探讨

细胞培养是实验最基础的实验手段,如何制好细胞包埋块,却不是一件容易的事情,现在介绍一种方法,大家试试。
一、透射电镜处理:1、培养瓶内细胞培养的,先将培养液倒掉,用生理盐水或缓冲液漂洗一次,然后将固定液倒入培养瓶内将细胞全部浸入固定液内约半小时,然后用胰酶消化处理,将消化下来的细胞离心成团,根据血清预包埋法进行处理即可。2、载玻片培养的(光滑面),将玻片用生理盐水漂洗干净后,用刀片沿着玻片边缘切割出矩形细胞片,再用固定液浸泡30分钟,然后在冷的生理盐水中摇换,使细胞片自然脱落,如果不能自然脱落,可用镊子及刀片协助剥离。这种处理方式可很好地观察细胞间的连接情况。然后按常规方法处理。
2、扫描电镜处理:1、培养瓶内细胞培养的,用生理盐水或缓冲液漂洗一次,然后将固定液倒入培养瓶内将细胞全部浸入固定液内约半小时,然后用胰酶消化处理,将消化下来的细胞离心成团,然后常规处理,但这种处理方法容易将细胞表面结构造成破坏。2、破坏性处理:先用生理盐水漂洗后将玻璃培养瓶打碎,取出1-2厘米大小的碎片(有细胞)浸入固定液内固定30分钟,进行常规操作处理,用冷冻干燥法干燥。3、盖玻片(1cm)细胞培养:将细胞直接培养在盖玻片上,清洗干净后按常规方法处理即可,冷冻干燥法干燥。载玻片培养的应该将玻片切割成1cm大小进行处理。这种处理方法可以很好地保存细胞的培养时的形态。以上方法,仅供参考!

[ 本帖最后由 fzxd888 于 2017-11-23 10:54 编辑 ]
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取材问题补充

从目前的情况来看,电镜标本取材还没有一个规范性操作标准,由于科研项目的要求不同,取材方式会有些许差异。但是电镜取材与光镜取材有着明显不同之处,由于电镜观察的局限性以及很高的一致性-即标本经过固定后与生活时的状态要非常接近,需要在尽可能短的时间内标本得到固定,因此,电镜取材才会有“快、小、冷、准”的要求。但是,很多学生对这个要求理解不透,取材失误也就在所难免了。有些学生担心取不到需要观察的位置,因此就取得较大一块标本,最终导致标本固定不良失去了观察意义,费时费力却得不到结果,白忙活!因此,任何生物标本必须严格按照上述四个要点进行,如果真的做不到“快”,但至少要做到“小”,小是最关键的要求,即标本的大小要小于1毫米,在保证取材部位准确的前提下尽可能的“小”,标本数量尽可能些,这样就可保证标本的完整性。因为每个包埋块都要先进行半薄切片观察,总会找到需要观察分析的位置。其实那些取得较大块的标本只要多切几刀,分成若干个小块即可,其实这个操作并不难!这也说明大多数学生对取材和结果相关性的认识不够,对取材的重要性没有引起足够的重视有关!
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