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下面介绍下免疫组化方法的具体实验流程步骤。
实验流程简介
一、SP三步法
1）石蜡切片，常规脱蜡至水。
2）0.3%或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。
3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟
4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。自然冷却，再用3分钟×3次.
5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。
6）滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜（最好复温）。PBS冲洗，3分钟×5次。
7）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30分钟-1h。
8）PBS冲洗，3分钟×5次。
9）滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30分钟-1h。 10）PBS冲洗，3分钟×5次。
11）显色剂显色（DAB等）。
12）自来水充分冲洗。
13）可进行复染，脱水，透明。
14）选择适当的封片剂封片。
二、即用型二步法
1）脱蜡、水化组织切片。
2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。
3）0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS冲洗。
4）滴加一抗，室温或37℃孵育30~60分钟，或4℃过夜，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。
5）滴加enhangcer增强剂，37℃30min，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。
6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体，室温/37℃孵育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗，3分钟×5次。
7）应用DAB溶液显色。
8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。
三、免疫荧光技术（略）
1、酶免疫组化的关键环节
1）标本固定
固定的目的是 ① 防止标本从玻片上脱落；
② 除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；
③ 固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用4%多聚甲醛，但睾丸组织、眼可能要选用Bouin’s液或mDF液效果较好。
2）脱水、石蜡包埋和制片
脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。
3）脱蜡和水化
这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60℃20min，然后立即二甲苯1-3分别10min（这个时间是由二甲苯新鲜程度和室温等综合决定的），但当天制好的切片一般先60℃ 3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。
4）抗原修复
由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等）。我们实验室一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。注意微波修复后自然冷却30min左右（只要你觉得修复液的温度达室温即可）。
5）细胞通透
目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学（>10um厚切片） 和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。同时也是一种去污剂，一般在PBS中加入后终浓度是0.05%即可，而前者终浓度是0.5%-1%。石蜡切片4um左右可以不通透，因为细胞已经被切开了。
6）灭活内源性过氧化物酶和生物素
在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后4℃避光保存。不过，现在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒”避免内源性生物素的干扰，推荐使用。
7）血清封闭
组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温10-30min。但也要防止封闭过度
8）一抗和二抗浓度和孵育时间
一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4℃、室温、37℃，其中4℃效果****；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37℃1-2h，而4℃过夜和从冰箱拿出后37℃复温45min。具体条件还要摸索。
二抗孵育条件：二抗一般室温或37℃ 30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。建议一抗反应在4℃****，反应温和，但时间最好超过16~24h。
9）抗体稀释液
其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。正因为这种原因，我一直用国产的专用抗体稀释液，一段时间在更换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果（提示可能一抗没有结合），最后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后，发现是新抗体稀释液的PH值偏酸，而使抗原抗体反应不佳，终而出现假阴性结果。
10）切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）
为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。
注意：① 单独冲洗，防止交叉反应造成污染。
② 温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；
③ 冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。
④ PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）
11）DAB显色
背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4℃过夜）；另一方面就是封闭时间过长。
12）复染
目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染（胞核染料）。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则要短。不过这个如果染色不理想可以补救的。方法是：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。
13）封片
为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。

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2、免疫荧光方法中的重要环节
1）冰冻切片制备
建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。
2）组织切片固定
切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。
3）血清封闭
为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。
4）一抗孵育条件
在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4℃、室温、37℃，其中4℃效果****；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37℃1-2h，而4℃过夜和从冰箱拿出后37℃复温45min。具体条件还要摸索。
5）二抗孵育条件
二抗一般室温或37℃30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。
6）复染
目的是形成细胞轮廓，从而更好对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。
7）封片
为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。
8）切片清洗
为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。
注意：
（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。
（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；
（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。
（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议pH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（pH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）
9）拍照
有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序；应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后；标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油；电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。
3、免疫组化和免疫荧光结果分析：见第一场试验讲座。
案例一 DAB染色后切片着色一片黄/背景深
背景： 奥运会期间我们课题组研究生都在实验室做实验，许多从北京购买的试剂买不到，对我们的许多实验产生了很大的影响。我以前一直用中杉金桥的SP三步法染色试剂盒，效果不错，在奥运会期间我准备做同批实验分不同批次酶免疫组化实验，第一批组化实验结果很好，抗体浓度感觉比较合适（Santa Cruz公司1：200），等做第二批时发现封闭血清不够了，为了保证实验顺利进行，我又从福州迈新顶了一个SP试剂盒，同时抗体稀释液也不够了，我又重新从博士德公司买了一小瓶10ml。从第二批实验开始，组化实验结果一直显示强背景着色，特异性染色很难辨别。后来我将标本拿到上海舜田生物去做，做了效果很不错，于是我就请教了他们公司从事病理30多年经验的花老师，她告诉我应该如何去分析和解决问题，很快我就找到了思路，结果问题终于解决了。
问题及其解答：产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？
1、 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。
2、 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。
3、内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
4、 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
5、 DAB孵育时间过长或浓度过高；
6、 PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤为重要；
7、 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。
我的实际解决方案： 以上的分析可能对于初学者还是不容易的，下面我就把我的排除实验的具体过程与大家进行分享、交流和讨论。
1、首先排除抗体孵育条件。一般来说，着色效果的好坏与抗体的孵育条件是密不可分的，由于用SP法已经做出来过一次且效果不错，因此对于同样组织的同一抗原进行分析，这种因素可以先排除。
2、其次，DAB孵育时间是否太长？做出来那一次我是孵育8min，后来也是8-10min，我单独做了一次实验来排除该因素。结果孵育2、5min时先出现背景，而特异性染色较浅，故这不符合常理，一般先出现特异性染色，然后随着时间的延长，会出现非特异性背景着色。
3、最后，血清封闭的问题？以前我一般孵育15-30min，所以我单独做了一次实验用血清封闭室温1h，其它条件同做出来的那一次，结果也一样背景着色很深。
4、此外，我在改进的同时，也对PBS清洗不断地延长时间和增加次数，甚至完全参照试剂盒说明书来进行操作（我以前一般一抗4℃过夜且室温复温45min、二抗37℃30min、SP反应37℃ 30min），以及过氧化氢灭活加强等等均未起到效果。 我冷静地分析了一下整个实验流程，与第一次做出来相比，只有两个地方做了改动：因血清不够而更换了不同厂家试剂盒、因抗体稀释液用完而重新买了抗体稀释液。
5、我用PBS替代一抗稀释液（我以前还回收抗体，自我觉得抗体稀释液中含防腐剂和蛋白稳定剂），其它步骤和组织切片完全与第一次做出来的一致（包括血清也是老试剂盒内剩余的一点），奇迹出现了：结果很好。因为抗原抗体反应除温度、抗原/抗体浓度外，然后就是pH值，于是我测了新抗体稀释液、老抗体稀释液和PBS的pH值，结果是前者偏酸性（<6、0），而后两者均在7、5左右。
6、看来主要祸根是抗体稀释液的pH值出问题了，于是我又用PBS替代抗体稀释液和新试剂盒内的试剂对组织切片做了免疫组化，结果还是没有做出来：背景很深。这真把我搞惨了。难道还有什么原因吗？通过仔细分析：一抗一定是结合上去了（老SP试剂盒结果很好），问题是二抗没有结合上去也不对（因为最后背景很深，这说明二抗可能也结合上去了），DAB孵育时间现在只用1、5min也是背景深而特异性染色浅，那我又怀疑封闭血清了。
7、我做了两张切片：一张用老试剂盒内还剩下一点的血清而另一张用新试剂盒内的封闭血清，其余试剂（二抗、SP）均用新试剂盒提供的，结果是前一张效果很好，而后一张能够看到特异性染色，但背景太深，拍照效果不佳。看来封闭血清也是罪会祸首之一。 结果分析显示：抗体稀释液的PH值偏低和封闭血清的失效导致了我的免疫组化结果的不佳，望大家在以后的组化实验中也要注意这两个不太引人注意的关键问题。惨痛的教训，值得引以为鉴。
案例二 DAB染色后切片着色呈阴性结果
背景： 其实免疫组化在DAB染色后一般有四种情况：阳性染色效果很好、阴性染色、非特异性染色很深、阴阳脸（染色不均匀）。而阴性染色是许多初学者经常遇到的头疼问题。我身边有个研究生同学在我们实验室初次涉入免疫组化，听说步骤不难，跟我后面做了几次之后，就自己开始做了，连续做了三次，结果均是阴性染色。很扫兴，不知是什么原因导致的，后来我还是请教了上海舜田生物花老师，她免费提供给我我很大的帮助，解决问题的思路也逐步清晰。
问题及其解答：免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？
1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不知抗体是进口的还是国产的工作液，怎么这么高稀释度也没能做出阳性结果？另外，不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索****浓度。
2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是****的时间和次数。若不行，还可高压修复。
3、组织切片本身这种抗原含量低；
4、血清封闭时间过长。
5、DAB孵育时间过短。
6、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。
7、开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

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我的实际解决方案：
1、首先，排除组织切片内的抗原有无丢失及其含量多少。免疫组化中两个最重要的因素是抗原和抗体。
（1）抗原有无丢失主要看组织切片的新鲜程度，一般切片室温保存超过3-6个月，可能切片内的抗原丢失很严重（有文献支持），此时可以通过重新用石蜡块切片来进一步验证（蜡块需要低温保存）。
（2）石蜡切片在制作过程中可能因醛基对抗原决定族的封闭，这需要通过抗原修复来充分暴露，从而增加抗原抗体结合反应，提高阳性率，我一般用6min*4次中火微波抗原修复，用枸橼酸钠缓冲液。
（3）组织切片中本身抗原含量的多少？这方面我有教训的，我做胎鼠睾丸间质细胞鉴定，用1：200一抗效果很好；但我用1：200一抗孵育成年睾丸间质细胞检测，几乎呈阴性，后来证实是因为两者抗原含量相差甚远，则一抗也要适当提高浓度。
2、其次，检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件是否不适。
（1）一抗选择单克隆抗体易出现阴性结果，因为灵敏度低但特异性好；一抗的species reactivity中无检测组织的种属，这是比较常见的错误；一抗选择rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出现阴性结果。
（2）抗体孵育时间过短，容易导致阴性结果。一般一抗我建议4℃孵育过夜和37℃复温45min；二抗我一般37℃30min。我不喜欢参照二抗染色试剂盒说明书。
（3）抗体浓度过低。这是阴性结果的最可能原因。必须提高稀释度，我一般初次做一种新抗体，喜欢先用说明书建议的低浓度和高浓度做一次，然后决定是向高还是低方向摸索。一般先决定二抗的浓度（工作液就好办了，直接滴加），重点摸索一抗的最适浓度。注意：免疫反应中存在前带和后带效应，这提示不是浓度越高，阳性率就越高，反之亦然。
（4）重要原因排除之后，也不要忽视抗体的质量：原装抗体一般比较稳定，效果较好；而进口分装次之；工作液可能要注意质量问题。
3、同时，DAB的孵育时间可能要适当延长，在镜下观察，有时可延长至30min。但一般3-10min最好，此时背景也较浅。否则，说明抗体浓度不合适。
4、最后，血清封闭时间也可相应缩短。一般10-30min，但这个时间可以调整，封闭主要是降低切片的总体背景着色。
5、此外，细胞通透也不可忽视。许多战友认为石蜡切片一般不需细胞通透，因为切片时可能已经把细胞切开了，但对于胞核蛋白，建议还是通透一下，促进抗体等试剂充分进入参与反应。
6、以上原因，都是针对实际中常见原因来进行分析的，前提是排除操作者的操作错误而引起阴性结果，这就需要新手还是要设置阳性对照以排除方法的问题。还有抗体稀释液的pH值过低等其它原因的干扰。 总之，要想把免疫组化做好，可能每一个环节都很重要，但也存在主次之分，出现问题了，需要通过先排除主要的，再依次排除次要的--这是衡量你对免疫组化原理掌握与否的关键所在。
案例三 石蜡切片免疫荧光染色呈阴性结果或非特异性结果
背景： 因实验需要，于2008年07月04日初次做肝脏组织ZO-1（一种胞膜蛋白，紧密连接蛋白）免疫荧光染色，以前我对酶免疫组化非常熟悉，在丁香园子内也有不少置顶贴和精华帖，但免疫荧光一直还没做过（原理知道，但细节不太了解）。我先用石蜡切片做了5次，结果一直不理想（表现为未见特异性强染色）；近几日，在舜田生物花老师的帮助下，我又切了冰冻切片，做了2次，终于基本成功了。在这个过程中，我对免疫荧光染色技术有了全新的认识，而前些天发出免疫荧光求助贴，回复的很少，所以有必要加强对免疫荧光方面的讨论），不妥之处敬请指正。有人会问酶免疫组化做的好好的，为何要做免疫荧光？其实，这也是我以前思考的难题，现在我认为可能胞膜蛋白含量不高，用普通免疫免疫组化可能做不出来，需要敏感的免疫荧光方法来进行蛋白检测（我是看许多外文文献都是这样做的，因此选择免疫荧光染色。）
问题及其解答：如何降低非特异性荧光染色和避免阴性着色？
1、非特异性染色产生原因及其解决方案：
（1）游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。二抗配置时用透析法或层析法分离荧光素标记的二抗和游离的二抗。购买高质量、高纯度的荧光素二抗。
（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。
（3）组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。延长血清封闭时间。
（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。
（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
（6）荧光素不纯、标本固定不当等。
（7）一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。调整一抗和二抗孵育条件和浓度至****。
（8）一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。
2、阴性染色产生的原因有：
（1）一抗和二抗浓度不合适或孵育条件不妥。
（2）荧光素提前衰退。荧光素质量不佳或操作过程中没有注意避光等防止荧光素衰退的事项。
（3）血清封闭时间过长。
（4）抗体稀释液PH值不合适，影响抗原抗体反应。
（5）组织切片不平、裂片或脱片很严重，易引起大块阴性着色。
（6）组织标本不新鲜或已经冷冻组织制成的切片中抗原易弥散，易引起本来表达的部位阴性染色或弱着色。
（7）荧光显微镜不会使用，激发波长选择错误。

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已有的常见免疫组化难题集锦
1、石蜡切片和冰冻切片的比较？
（1）要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是今天我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。
（2）冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。
（3）石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80℃的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到4微米左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。
2、一抗的选择要点和技巧是什么？
（1）单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。
（2）应用范围的选择。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。
（3）种属反应性的选择（species reactivity）。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。
(4)种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。
(5)生产厂家的选择。如santa Cruz公司抗体一般1ml，价格2100元左右；而chemicon公司一抗一般100ul，价格2800元左右。这两个厂家的同一种抗体它的实际效价稳定是不同的，我一般用后者抗体做免疫组化效果较好，而前者做Western blotting效果还可以。
3、在什么情况下使用TritonX-100？
（1）Triton X-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学(>10um厚切片) 和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。
（2）其作用原理：Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
（3)Triton X-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用，具体参阅： http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=68&id=12301317&sty=1
4、封闭血清的选择原则是什么？
（1）膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！
（2）封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。
（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
5、抗体孵育条件的比较？
（1）一抗孵育温℃有几种：4℃、室温、37℃，其中4℃效果****；孵育时间：这与温℃、抗体浓℃有关，一般37℃1-2h，而4℃过夜和从冰箱拿出后37℃复温45min。
（2）二抗一般室温或37℃30min-1h，具体时间需要摸索。
6、一抗4℃孵育后为什么要进行37℃复温？
（1）一方面，防止切片从4℃直接放入PBS易脱片；
（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4℃和37℃时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速℃小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
（3）其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4℃过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩！
7、DAB显色时间如何把握？
（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；
（2）DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；
（3）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；
（4）DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4℃过夜）；另一方面就是封闭时间过长。
8、免疫组化结果如何分析？
（1）阳性着色细胞计数法。在40*光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。
（2）灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。
（3）评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。 对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。
9、在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么？
（1）由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。
（2）修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等）。
（3）微波修复，我们一般用6min*4次，效果不错。
10、内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？
（1）一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右；而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min。
（2）用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片.
（3）现用现配，配好后4℃避光保存。

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11、如何才能充分脱蜡？
（1）蜡不溶于水，如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起染色不均匀、阳性物时隐时现、真假难辨、背景染色增加等。为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短；
（2）脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜谋面是在不同。如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长。
（3）当天切的切片，烧烤2小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温10-20分钟，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果魁伟更好。 总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决定，脱蜡的时间，原则上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。
12、如何****限度地降低组织非特异性染色？
（1）缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。
（2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。
（3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
（4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
（5）缩短DAB孵育时间或降低DAB浓度/过氧化氢浓度等；
（6）适当增加PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；
（7）防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。
13、苏木素复染时间的把握？
（1）苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。
（2）盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。
（3）如果分化的颜色过浅，可以复置于苏木素中染色。
14、PBS的清洗方式选择、次数和时间的选择？
（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。 临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。
（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。 冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲出的PBS有一定的冲击力，很容易使切片周边引起松动，导致切片的脱落。
（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。 冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法一是浪费时间，二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入PBS，持续2分钟左右就完全足够了。
（4）PBS的pH和离子强度的使用和要求。 刘彦仿指出：中性及弱硷性条件（pH7－8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。
免疫组化P56我们目前常用的PBS的pH在7.4-7.6浓度是0.01M，根据本室十几年来的使用情况，认为该溶液价格便宜配制方面，使用效果好。
（5）常用试剂的配制和使用。 在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中，抗体的加、换、切片的冲洗，DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱，都将影响染色的结果。
15、脱片产生的原因和如何防止脱片？
（1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。
（2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。
（3）组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。
（4）没烤好，时间短温度不够之类。
（5）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。
（6）修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100℃的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。
（7）此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。
16、背景染色较深的原因有哪些？
（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。
（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
（4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。
（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4℃冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。
（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
17、苏木素复染后氨水返蓝这一步如何做、浓度多少、时间多长?
答：返蓝可以用碱性溶液（PBS/Na2HPO4/淡氨水）或45℃温水、冷水蓝化均可。一般蓝化5~10 min。淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵。