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自然流产(SA)小鼠模型

自然流产(SA)小鼠模型

  • 原型物种

                               
  • 来源

    Clark经典反复流产小鼠模型(CBA/J与DBA/2)

                               
  • 模式动物品系

    雌性CBA/J,雄性DBA/2,雄性BALB/c小鼠

                               
  • 实验分组

    正常妊娠对照组,健康未妊娠对照组,RSA模型组,RSA治疗组

                               
  • 实验周期

    6~8 weeks

                               
  • 建模方法

    RSA小鼠模型建立
    将雌性CBA/J与雄性BALB/c小鼠按2:1比例合笼交配建立正常妊娠小鼠模型,雌性CBA/J小鼠与雄性DBA/2小鼠按2:1比例合笼交配建立(复发性流产)RSA小鼠模型,检出阴栓者计为妊娠第0天。
    实验共分4组:
    治疗组(雌性CBA/J 10只、雄性DBA/25只)
    RSA模型组(雌性CBA/J 10只、雄性DBA/25只)
    正常妊娠对照组        (雌性CBA/J 10只、雄性BALB/c 5只)
    健康未妊娠对照组(雌性CBA/J 10只)
    各组从妊娠第0日开始灌胃给药,每组10只雌鼠。
    剂量根据成人70kg临床用药剂量按动物体表面积换算,灌胃容积均为0.4mL/20g。正常妊娠组和RSA模型对照组给予相同体积蒸馏水,连续灌胃给药14d,末次给药1h后处死小鼠,取其外周血和蜕膜组织。

                               
  • 应用

    可用于研究预防和治疗RSA的药物

  • 模型评价         

  • 流式细胞数检测PBMCs中Th17/Treg细胞比例:
    分离小鼠PBMCs后,按工作浓度加入佛波酯,Ionomycin,Monensin,37°C孵育4~6h,设同型对照管和检测管。Fc受体阻断剂封闭后,分别加入CD4表面抗体染色,混匀,室温避光孵育15min后每管按操作要求先后加入固定液和破膜/溶血液,洗涤后实验管分别加入2种配色抗体,对照管加入同型对照抗体。避光孵育后,加入洗涤剂离心弃上清,重悬细胞,24h内上机检测。以CD4直方图射门,以散点图染色阳性表示Th17细胞和Treg细胞,用Cellsquest软件获取并分析数据。(一个样本分为两种染色方案,Th17:CD4-FITC、IL-17-PE;Treg:CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE)

    RT-PCR检测PBMCs中FOXP3、RORrt、STAT3、STAT5的表达:
    分别提取各组PBMCs总RNA,并进行RNA纯度和完整性鉴定;设计引物,逆转录成cDNA,以β-actin为内参,然后进行实时荧光定量RT-PCR;采用相对定量法利用Ct计算FOXP3、RORrt、STAT3、STAT5 mRNA的相对量。

组织病理学
1.HE染色观察局部组织细胞病理结构改变:
取各组小鼠蜕膜组织,包埋石蜡切片,HE染色。
2.电镜观察局部组织细胞凋亡和病理结构改变:
无菌取各组小鼠蜕膜组织,加入2.5%戊二醛进行预固定,1%锇酸进行后固定,再逐级用乙醇和丙酮进行脱水,树脂包埋,制备成超薄切片,醋酸双氧铀-硝酸铅溶液进行双重染色,置投射电镜下进行观察。
3.免疫组化分析局部组织细胞因子STAT3、STAT5表达:
4.RT-PCR检测蜕膜组织中的FOXP3、RORrt、STAT3、STAT5  mRNA表达。
5.Western blot检测蜕膜组织中的STAT3、STAT5蛋白表达
标志因子水平
6.1ELISA检测脱膜组织匀浆中的IL-2、IL-6。
收集各组蜕膜组织,组织匀浆后取上清进行ELISA检测。

6.2ELISA检测细胞因子IL-2、IL-6和TGF-β1表达:
取各小鼠血清,使用IL-2、IL-6和TGF-β1 ELISA kit,按照试剂盒说明书进行操作,在酶标仪上设定标准曲线,每个标本和标准品均设3个复孔。用酶标仪读取血清样本的吸光度值(A),通过标准曲线计算样本浓度值。
统计学分析
应用SPSS软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x ±s)表示,采用t检验,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05表示有显著差异

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