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干眼症治疗的新靶点-消皮素D

干眼症治疗的新靶点-消皮素D

题目:NLRP12- and NLRC4-mediated corneal epithelial pyroptosis is driven by GSDMD cleavage accompanied by IL-33 processing in dry eye

期刊:The Ocular Surface

影响因子:12.336

2020729日,来自中山大学中山眼科中心眼科国家重点实验室的Wei Chi教授在“The Ocular Surface”发表了题为“NLRP12- and NLRC4-mediated corneal epithelial pyroptosis is driven by GSDMD cleavage accompanied by IL-33 processing in dry eye”的文章。研究发现一种与NLRP12NLRC4相关的炎症诱导、消皮素D依赖并伴有IL-33参与的焦亡机制。这种机制对受到环境影响产生的眼表上皮缺损负责。IL-33的处理以及之后扩大的炎症级联必须有消皮素D的参与。这预示着新的治疗靶点的出现。


研究简介:

干眼症是一种常见的多因素性自身免疫性眼表疾病。干燥(Desiccating stress, DS),高渗透压等环境因素会影响角膜上皮细胞,从而诱发眼表炎症。炎性小体引起的细胞焦亡是程序性细胞死亡的一种促炎形式。其以caspase-1/11 (CASP1/11)诱导消皮素D (GSDMD)促进细胞裂解为特征。而GSDMD是膜孔形成、细胞破裂和促炎细胞因子释放所必需的。

为了深入探究干眼引发的病理分子改变,作者DS处理的小鼠角膜上皮细胞和对照组进行了RNA-Seq。分析结果表明,DS损伤涉及多个与炎症和免疫有关的通路。因为干眼症是自身免疫性疾病,因此作者通过研究免疫系统过程途径,发现焦亡关键底物GSDMD的表达在该途径上调。并且,与对照组相比,DS处理的小鼠角膜上皮中的GSDMD水平升高。为探究GSDMD在干眼症中的作用,作者敲除小鼠的GSDMD基因,发现在DS处理下,相较于正常小鼠,基因敲除小鼠泪水流失更少。此外,GSDMD基因的缺失减弱了眼表疾病,并导致角膜上皮缺损数量的减少。作者同样通过RNA-Seq筛选到TLR4,并进一步探究TLR4GSDMD之间的调控机制。通过免疫荧光染色分析发现TLR4基因敲除小鼠中的GSDMD的表达显著降低。这些发现都证明TLR4GSDMD上游起作用并且与焦亡有关。

作者在DS处理的小鼠角膜上皮细胞中检测到NLRP12NLRC4水平的上升。在NLRP12NLRC4基因敲除小鼠模型中,DS处理的第一天,泪液体积就迅速减少,NLRP12的缺失不仅显著降低了泪液减少的程度,而且显著改善了角膜缺损的愈合。这些发现表明,NLRP12NLRC4作为促炎触发器,在干眼症发展过程中调节眼表疾病。通过qRT-PCR和免疫印迹实验,作者发现敲除NLRP12NLRC4蛋白和mRNA水平显著降低,敲除NLRC4NLRP12蛋白和mRNA水平显著降低。并且,NLRP12NLRC4的敲除可显著阻断CASP1IL-1GSDMD的裂解,角膜上皮中的GSDMD显著降低,证实NLRP12NLRC4诱发了干眼症中GSDMD依赖的焦亡。之后,作者使用YVAD抑制CASP1活性,抑制了IL-1β的生物活性以及N端的GSDMD生成,而重组CASP1蛋白的加入则相反地促进了IL-1蛋白和GSDMD的裂解。这些结果证实了NLRP12NLRC4炎性小体在干眼症中相互调节并依赖CASP1诱导的GSDMD裂解促进焦亡作用。

作者假设NLRP12NLRC4炎性体的激活可能参与了TLR4介导的焦亡。实验发现,在体内和体外,消除TLR4显著降低了NLRP12NLRC4在蛋白和mRNA水平的表达。同时,免疫荧光染色检测到TLR4敲除小鼠角膜上皮中NLRP12NLRC4的表达显著降低,并且NLRP12/NLRC4炎性体相关蛋白水平以及下游CASP1蛋白水解作用显著降低。因为CASP8是细胞凋亡的启动子,作者发现体内TLR4的异位缺失或体外敲低TLR4可明显抑制CASP8的激活。在CASP8敲除的小鼠中,眼表损伤减少,泪液明显增多,并且抑制了NLRP12 NLRC4炎性小体体内体外活性。这都表明CASP8DS引起的眼表疾病的恶化负一定的责任。

之后,作者为了探究IL-33在焦亡时的功能和机制,将重组IL-33蛋白和抗体分别应用于角膜,结果发现与DS组相比,重组IL-33蛋白组泪液生成明显减少,角膜缺损增加。并且,作者发现在GSDMD敲除小鼠中IL-33对角膜上皮的处理显著减少。在恢复GSDMD敲除小鼠的GSDMD的水平后,IL-33的水平也明显上升。并且,NLRP12NLRC4敲除和药剂阻碍CASP1小鼠的IL-33生物活性水平均下降。这都说明GSDMD引起的焦亡能刺激IL-33的合成。
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