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标题: 求教：冰冻切片免疫组化染色 [打印本页]
作者: sdnick    时间: 2010-3-21 20:05     标题: 求教：冰冻切片免疫组化染色

请教各位老师：
我要做大鼠脑fos基因免疫组化，需要冰冻切片。请问为什么必须冰冻切片？石蜡切片可以吗？

冰冻切片免疫组化染色的步骤和注意事项都有哪些？

请赐教呵。谢谢！
作者: shanghainese    时间: 2010-3-25 13:57

先看看别人是怎么做的.
作者: sdnick    时间: 2010-3-25 16:36

冰冻切片做好后，先染色，最后裱片。切片在PBS等液体中处于游离状态，如何操作？
谢谢！
作者: shanghainese    时间: 2010-3-26 12:51

一时半会儿讲不清楚
作者: sdnick    时间: 2010-3-29 09:24     标题: 回复 4# 的帖子

请4楼大概描述一下也行呵……

能推荐相关文献吗？
作者: shanghainese    时间: 2010-3-29 14:11

多年以前在这里有过讨论.
您翻翻旧的帖子吧!
作者: songhaiyan    时间: 2010-4-1 20:16     标题: 免疫组化步骤

　(1) 切片常规脱蜡至水; (2)
30 %H2O2 1 份+ 蒸馏水10 份混合,室温5～10 min
以灭活内源性酶,蒸馏水洗3 次; (3) 热修复抗原:将
切片浸入0. 01 mol/ L 枸橼酸盐缓冲液(p H6. 0) ,微
波炉加热至沸腾后断电,间隔5～10 min 后,反复1
～2 次,冷却后PBS (p H7. 2～7. 6) 洗涤1～2 次;
(4) 滴加5 %BSA 封闭液,室温20 min ,甩去多余的
液体,不洗; (5) 滴加一抗兔抗ghrelin (1 ∶200 ,武汉
博士德,BA1619) ,4 ℃过夜; (6) 滴加生物素化山羊
抗兔IgG,37 ℃20 min , PBS 洗2 min ×3 次; (7) 滴
加试剂SABC ( SA1022 ,武汉博士德) 37 ℃20 min ,
PBS 洗5 min ×4 次; (8) DAB (AR1022 ,武汉博士
德) 显色20 min ,蒸馏水洗涤; (9) 苏木素轻度复染,
脱水,透明,封片。显微镜观察,阳性产物呈棕**,
阴性对照组则无阳性产物。对照组用PBS 代替一
抗,其余步骤同上。
作者: songhaiyan    时间: 2010-4-1 20:17     标题: SABC（Strept Actividin-Biotin Complex）法

SABC（Strept Actividin-Biotin Complex）法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的免疫组化染色方法。由于该方法中的链霉亲和素的等电点接近中性（pH=6.0-6.5），对组织和细胞的吸附性特别低，因而具有较低的背景。它的步骤与其他免疫组化染色基本相似，有良好的可操作性。
1)、载玻片防脱片剂处理：应用多聚赖氨酸涂片时，应使用塑料容器稀释多聚赖氨酸，防止多聚赖氨酸过多吸附于容器上，在染色时出现脱片现象。
2)、切片常规脱蜡至水：二甲苯虽然可以反复使用，但次数不宜多。乙醇的浓度是从高到低，与脱水时相反。
3)、灭活内源性酶：博士德推荐应用3%的双氧水，但实际操作中，使用30%双氧水和纯甲醇按1:9的溶剂比混合较为理想。
4)、抗原修复：由于β1-integrin在细胞膜上表达，因此没有必要进行热修复抗原或者微波修复抗原，只用到了抗原修复液。
5)、正常山羊血清封闭：封闭时应该注意室温与时间的相对关系。室温低，时间就要长一些，反之亦然。另外，保持反应池湿润是重要的一环，否则，前功尽弃。后面的步骤也是如此。
6)、一抗反应：一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度与背景有直接关系。一般说来，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时则相反。
一抗的浓度：这需要自行探索，虽然试剂公司给出了参考浓度，但仍然要探索出恰当的浓度，任何取巧的念头都是在自讨苦吃。
孵育时间与温度：抗原抗体充分反应是得到可靠结果的关键。因此，控制温度与时间也是一个严肃的问题。由于室温控制较为困难，建议4℃冰箱过夜（≥18h）。
7)、二抗（生物素化山羊抗兔IgG）反应：观察发现，37℃条件下二抗反应20分钟，尽管反应池保持湿润，但在排除了其他因素后，仍然得不到阳性结果。原因在于，二抗没有与其他溶液混匀而聚集在反应池四周，在37℃孵育20分钟甚至更长的时间后，二抗干燥，根本没有充分反应。解决的方法是：二抗的量要相对多些，同时要混匀；随时观察反应池的情况。
另外一种原因，就是仪器显示温度37℃，但实际只有23℃，自然结果难以令人满意。因此，查找原因时，不应被表面现象迷惑，应该认真地落实每一步，才能找到解决办法。
8)、SABC染色（37℃）：直接就可以用。
9)、DAB显色镜下控时：DAB浓度应该比推荐的要低一些，这样可以便于控制反应时间以及在合适的时候中止反应。同时注意，使用后残余的DAB应妥善处理，而不是随便倒入下水道，因为它可能有致癌性。
10)、苏木素轻度复染：不建议使用。尽管复染后标本层次分明，但实际情况是，这样有时也会掩盖阳性结果，从而使前功尽弃。
11)、脱水透明：脱水乙醇的浓度由低到高，有一个较准确判断脱水成功与否的办法是：观察透明后盛二甲苯容器的壁，若发现白色雾状现象，则说明脱水不成功，应再次脱水。透明时间不要太长，1分钟左右就可以了。
12)、封片：封片时，中性树脂量宜少，同时注意不要产生气泡
作者: sdnick    时间: 2010-4-2 11:55     标题: 回复 8# 的帖子

衷心感谢您的详细介绍！现在的问题是：根据外文文献，鼠脑冰冻切片后，先不裱片，（切片在液体中应该处于游离状态），先染色，最后一步才裱片（捞片）。
切片无附着物，如何进行免疫组化染色？



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