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标题: 【求助】免疫组化染色不均的问题 [打印本页]

作者: 带球过人 时间: 2010-6-7 10:28 标题: 【求助】免疫组化染色不均的问题

各位老师好，最近在做组化的过程中出现局部染色不均的问题，具体情况表现为组织着色出现左阴右阳或外有内无（见

下图），而更令人奇怪的是这种情况基本都出现在左侧端（近标签侧），根据以上情况，我以个人工作经验分析整理了

一些原因，但都被自己一一推翻

1、我首先想到的是操作台不平整，导致湿盒没有放置水平：但同样的操作台和湿盒，同时却没有出现这个问题，而且我

在后来的工作中特意将湿盒一端垫高，情况仍存在，排除

2、抗体没有完全覆盖组织表面：在上述情况出现后，我特地注意过这个问题，并且矫枉过正地在问题侧加大试剂滴加范

围，未见好转，排除

3、脱蜡不净：情况出现在同侧，并且已延长脱蜡时间

4、滴加抗体未打均匀：即用型抗体同样存在这个问题

5、修复：修复结束后，打开盒盖，发现修复液未完全覆盖切片，可能导致修复不完全。这个原因其实是我认为可能性最

大的，并且一度将其锁定为直接原因，但一次发现修复液覆盖完全的情况下居然也出现同样问题

在下跟请各位老师在百忙之余为我分析原因，指点迷津，在下百拜！

另：操作方法为maxvision，微波修复

作者: 带球过人 时间: 2010-6-7 10:48 标题: 图（镜下）

选了几张稍好的，另外有的呈现境界分明的阴阳面，阴面无色，连背景都没有

作者: 带球过人 时间: 2010-6-7 10:56

来几张全景的

作者: dingwei 时间: 2010-6-7 13:11

（1）一般来说是一抗或者二抗或者是DAB有没有加到。
（2）如果都加到了，那是不是组织上留下的缓冲液或水分太多了，加一抗或二抗时有稀释的现象。
（3）以上问题都没有，看一下湿盒盖子上面有没有很多水蒸气的冷凝水。

作者: 带球过人 时间: 2010-6-10 14:58

谢谢丁老师，我再试试

作者: gy8800nihao 时间: 2010-7-12 12:21

想问一下，最近免疫组化苏木素着色很浅，即使换了新试剂和苏木素，包括增加苏木素染色时间也还是不上色，请教同仁有遇到这问题没？什么原因？谢谢

作者: 王华 时间: 2010-7-13 19:00 标题: 回复 3# 的帖子

根据本人的观察，在免疫组化操作中最容易被忽略的问题有以下几个（越是熟练的技术员越容易出现哦！）
一、组织脱蜡不干净
石蜡的化学成分是24~35个碳原子的烷烃，甲基为疏水基团。蜡在组织中残留多就完全阻隔了抗体与组织结合，导致局部假阴性；残留的少，烷烃分子的疏水作用就使石蜡分子非特异性的与抗体结合，导致局部假阳性。
解决：1、保证脱蜡时间足够（我用五缸二甲苯，每缸保证3分钟）；
2、脱蜡剂及时更换；
二、组织脱二甲苯不干净
这是造成“阴阳脸”与局部染色不均的常见原因，二甲苯（或别的脱蜡剂）残留在组织上，一入水，二甲苯就会因为表面张力的原因聚集在一起，有二甲苯残留的地方抗体完全不能与该处的抗原结合，导致该处完全阴性，与旁边的阳性组织有一个明显的分界线。脱蜡剂残留对HE影响不是很明显，但对免疫组化就影响大啦！
解决：1、勤换酒精，保证入水前一缸酒精没有脱蜡剂。
2、过酒精别太快啦！保证每缸1分钟，上下晃荡几下。

从你给出的图片来看，估计就是以上两个原因引起的
大家把注意力过多的盯在修复、加一抗、加二抗、显色上了，其实免疫组化的成败优劣在于每一步都要做到位，每一步都要达到需要达到的效果才行啊！脱蜡、脱二甲苯的工作，病理科做了几十年了，对越是熟悉的工作就越容易忽略。
做免疫组化的大忌：心急！
把心放平和一些，把每一步做到位，凡事并不是越快越好，高质量是需要一定时间的。
（个人观点，仅供参考）

[ 本帖最后由王华于 2010-7-14 08:16 编辑 ]

作者: dingwei 时间: 2010-7-13 19:08

脱蜡不干净或脱二甲苯不干净应该是不规则的点状区域，不是上图所示。

作者: 王华 时间: 2010-7-14 13:33 标题: 回复 8# 的帖子

丁老师说得很对，脱蜡不干净会出现不规则的点状区域，但只是表现之一，在实际操作中的细节处理不同引起的脱蜡不净的程度不同就会有不同的表现。
脱蜡时间长短、最后一缸脱蜡剂中来的含量多少、过酒精时间长短、最后一缸酒精中脱蜡剂的含量多少，使用不同种类的的脱蜡剂，以上五方面只要不同，引起的效果是不一样的。如果是蜡残留合并脱蜡剂残留，二者残留的量不同，那么表现就更“匪夷所思”啦！
“带球过人”提到：组织着色出现左阴右阳或外有内无，而更令人奇怪的是这种情况基本都出现在左侧端（近标签侧），使用的微波修复。
片子估计是标签端在上竖着放在修复液里修复的吧？如果有脱蜡剂残留，在修复过程中，脱蜡剂比水轻，就会逐渐聚集在组织的上端，片子竖着放“阴性”就在近标签侧，如果侧着放“阴性”就在向上的一侧，如果平着放出现“阴阳性”的区域那就没有规律啦。
我个人的建议：换干净的脱蜡剂和酒精（最好各4~5缸），脱蜡每缸保证3分钟，酒精每缸保证1分钟，再试试吧！

自爆内幕：以上免疫组化问题在我刚做免疫组化时出现过的，经过总结反思修正，没有再出现过类似现象。呵呵。。。

（个人观点，仅供参考）

作者: dingwei 时间: 2010-7-14 13:44

非常好！！！

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