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标题: 紧急求助！请各位老师帮帮我！ [打印本页]
作者: ddmhjl    时间: 2010-10-26 23:29     标题: 紧急求助！请各位老师帮帮我！

各位老师好，由于实验需要进行大鼠股骨标本的HE和免疫组化染色，首先需要进行的是骨标本脱钙。我现在使用的是10%的EDTA脱钙的方法（常温），请教几个问题：
1.使用EDTA脱钙的方法脱钙，应该常温放置或者4℃放置（另有人说在37℃或用微波可加快脱钙速度，不知道会不会影响抗原）？
2.大概需要多长时间可以脱钙完全？如何进行判断（我的组织已经脱了3个月了，感觉是软了，但是还是不能用大头针很轻易的刺穿，是不是脱钙仍不够啊）？
3.之前找公司用硝酸脱钙的方法染了几张HE的片子，整体感觉还行，但是发现脂肪细胞被破坏殆尽了（公司解释说是酒精脱水的时候被溶解了），看国外文献中的HE片子脂肪细胞可以很好的保存，不知道有什么办法可以不破坏脂肪细胞呢？
       请各位老师不吝赐教，先谢过了！
作者: dingwei    时间: 2010-10-27 11:35

1、首先用锯子把股骨锯成1-2MM厚的小骨片，否则你脱半年也脱不了。
2、每天更换EDTA脱钙液。
3、一般不加温，加温对免疫组化有没有影响不知道，没做过对照。
4、HE切片应该只留下脂肪细胞的支架，脂滴肯定会被溶解。国外文献中的HE片子脂肪细胞可以很好的保存，不知道是什么保存，如果说连脂还在，那肯定不对。
5、如果用EDTA脱钙比较慢，可以用10%盐酸福马林液试一下。
作者: ddmhjl    时间: 2010-10-27 16:35

谢谢丁老师的指点！但是大鼠的股骨本来厚度就不大（大概有3-4mm左右），很难再锯开了吧，而且一旦锯开之后，骨髓腔中的骨髓估计也就没了，所以就直接放进了脱钙液中了。还请教您几个问题：1.像我这种情况，组织在脱钙液中浸泡太久，对组织结构和抗原影响大不大？2.您提到的10%盐酸福马林液脱钙之后，会不会影响到后期做免疫组化啊？3.如果10%盐酸福马林液影响不大的话，我现在的组织可不可以转而使用此种方法脱钙？期间需要用流水冲洗将附着的EDTA冲干净吗（冲洗时间）？4.在首页看到的10%盐酸福马林液的配方是：40%的甲醛5ml，浓盐酸10ml，蒸馏水85ml。我现在的组织还需要再加甲醛进去固定吗，是不是要减掉甲醛的成分（手头也只有4%的多聚甲醛，应该如何配置）？5.用盐酸脱钙，大概得多久脱完全，脱钙终点如何判断（细针穿入？）？脱钙后，流水冲洗时间多久？6.脱水透明的步骤，这是我之前用的步骤，您看这样可以吗？ 75%乙醇 3-5 h，85%乙醇4h，95%乙醇（I）2h，95%乙醇（II）2h，100%乙醇（I）1h20min，100%乙醇（II）1h40min；正丁醇（I）2.5h，正丁醇（II）25h；石蜡（I）0.5h，石蜡（II）1.5h。
        我是个新手，问题有点多，呵呵，希望能得到您的指点，谢谢！

[ 本帖最后由 ddmhjl 于 2010-10-27 18:58 编辑 ]
作者: 代芳晶    时间: 2010-10-27 21:46

各位老师我是为新手，我想问一下我用冷却配法苏木精。为什么不愿上颜色，这是我第一次用这种方法配的
作者: dingwei    时间: 2010-10-27 22:00

1.像我这种情况，组织在脱钙液中浸泡时间越久，对抗原影响越大。
2.10%盐酸福马林液脱钙之后，会不会影响到你要做的免疫组化。不清楚，有的抗原有影响，有的没有影响。你的实验设计本身就不科学，安理你应该做好预试验后才开始正式实验，否则你怎么知道你那个方法是可行的？
3.可用流水冲洗将附着的EDTA冲干净，再用10%盐酸福马林液。
4.可以遥10%盐酸福马林液，如果要快的话，还可以用的30%。手头有4%的多聚甲醛，就别加了，按理应该先固定再脱钙。
5.用盐酸脱钙，时间也不清楚，能用细针穿入即可，脱钙后，流水冲洗时间4-6小时。
6.脱水透明的步骤可能。
作者: ddmhjl    时间: 2010-10-28 13:49

谢谢丁老师！还要请问您两个问题。1.我测定的蛋白有BMP-2、TGF-b1和FGF-2，您做过这几个用盐酸脱钙的实验吗，影响大不大？2.如果脱水、透明、包蜡后发现脱钙仍不够，有什么办法处理组织，使之能继续进行脱钙吗？
作者: dingwei    时间: 2010-10-28 14:08

1、没做过
2、可以，把蜡块切面放酸里泡
作者: ddmhjl    时间: 2010-10-28 16:39

谢谢丁老师！
作者: ddmhjl    时间: 2010-10-28 22:22

还要请教丁老师，10%的甲酸和盐酸比较，哪个效果更好些（对组织损伤小，免疫组化和HE染色较好）？
作者: dingwei    时间: 2010-10-28 22:53

不清楚，你可以试一下。
作者: ddmhjl    时间: 2010-10-28 22:56

还有说用50%甲酸的，哎，现在都晕了
丁老师，你们那里用10%盐酸脱钙后染免疫组化和HE效果还行吧？脱好之后需不需要用其它溶液来除酸啊，还是只是用流水冲洗？

[ 本帖最后由 ddmhjl 于 2010-10-28 22:58 编辑 ]



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