Board logo

标题: 免疫印迹实验 [打印本页]

作者: sunteam02    时间: 2011-6-16 15:48     标题: 免疫印迹实验

   
蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting),缩写为WB,是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。


可以提供免疫印迹技术服务的公司很多,上海舜田生物科技有限公司的服务质量相对是比较好的,而且服务质量和周期都能得到保证。上海舜田生物提供全套的免疫印迹技术服务,对蛋白进行定量和半定量分析。全部实验使用优质试剂,完全确保实验质量,客户只需提供标本和一抗(或通过舜田购买),舜田提供完整的实验资料和结果。

主要实验步骤如下:

1. 蛋白质抽提


a.
实验对象为组织样品,取适量(250~500mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品,加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂(或核蛋白抽提试剂),匀浆后抽提总蛋白(或核蛋白)。


b.
实验对象为细胞样品,每份样品取1×1061×107细胞,PBS清洗细胞,去PBS0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂(或核蛋白抽提试剂)抽提总蛋白(或核蛋白)。

2. 蛋白质定量


KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作,测定样品浓度。

3. 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)


将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样,标准加进第一个孔中,电泳分离蛋白。

4. 蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF


Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层,30mA恒流条件下,4°C转移过夜。

5. 膜的封闭和抗体孵育


a
.膜在5BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。


b.
封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时,抗原抗体结合。


c.
加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准,室温孵育膜1小时。加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。。

6. 结果检测


化学发光法检测,膜与化学发光底物孵育,经X胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件,并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。

7. 数据分析


目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值以校正误差,所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。

8. 提供实验报告

包括详细的实验方法及免疫印迹实验结果的相关图表。。

应用:
1.目的蛋白的表达特性分析
2.目的蛋白与其他蛋白的相作
3.目的蛋白的组织定位
4.目的蛋白的表达量分析


作者: shanghainese    时间: 2011-6-17 10:42

病理实验室一般不做Western blotting。




欢迎光临 中华病理技术论坛 (http://bbs.zhbljs.com/bbs/) Powered by Discuz! 6.0.0