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标题: 紧急求助免疫组化的问题 [打印本页]

作者: zjj1986 时间: 2011-7-20 20:56 标题: 紧急求助免疫组化的问题

做免疫组化也有一段时间了，虽然偶尔也会出现一些小问题，但是都可以找出原因自己解决的。但最近遇到的事情却让我很头疼，希望大家帮忙看看问题出在哪里。
步骤：1.常规切片脱蜡至水
2.3％过氧化氢孵育10min高压修复：1600W 冒气后 1min 10s自来水冷却
3.水洗后PBS洗5次，每次3min
4.一抗孵育(室温)1h后水洗，入PBS洗5次，每次3min
5. 二抗孵育（室温）30min后水洗，入PBS洗5次，每次3min
6.DAB显色
7.苏木素复染后封片
修复液和PBS是买的迈新的粉末自己加蒸馏水配的。DAB是买DaKo公司的。
我们做的时候一直没用血清封闭，因为买的是DaKo的二抗,本身有封闭的功效。
以前做的时候一直挺好的，最近老是出现DAB显色的时候一片黄染，检查过很多试剂，应该是没问题的。第二天重新做又回复正常了。可是昨天的片子做出来又是这种情况，今天重做还是不是很好，虽然有些还能看，但有些真的是不行，找又找不出原因。真快疯掉了。
还有另外一个问题就是DAB 显色的时候颜色还是很好的，可是苏木素复染后封片之后显微镜下看的时候，发现原先的DAB显色的颜色好像褪色了一样，有些地方只有些影子，边上一些黄黄的影子像是晕染开来似的。
想请教一下各位老师，帮忙解决一下。

作者: dingwei 时间: 2011-7-20 21:02

DaKo公司有一个加强型的DAB试剂盒，现在都是和检测系统（二抗）一起卖，效果还是很稳定的，不知你是否用这个？

作者: xkj2797xkj 时间: 2011-7-20 22:38

我们所有免疫组化试剂都是买迈新的，觉得这样会好些！要不把DAB的浓度调低点或显色的时间缩短，看看DAB显色的时候会不会一片黄染；复染的时候，苏木素染一分钟左右，看看会不会苏木素染长了覆盖了DAB试剂的显色！

作者: 刹那公子 时间: 2011-7-20 23:46

DAB快到期了吧？我们科的DAB一快到期，就这样，害得我每次不到时间就要扔....下次买小瓶装的，不要18ml的那种了。。。。

作者: promotion 时间: 2011-7-21 15:27

可能是阻断液的浓度低或阻断时间不够、一抗体孵育时间过长（看一下抗体的说明书，是30分钟还是60分钟）、DAB显色剂的浓度过高，特别是加强型的，反应时间太快，非常容易带出背景，如果还是没有解决，PBS多冲冲。
现在用自动染色仪，辅料就像不要钱的，至少是手工的5倍用量。

作者: zjj1986 时间: 2011-7-21 19:48

谢谢各位。
我们的DAB试剂盒确实是和二抗放在一起买的。

作者: wu126 时间: 2011-8-9 22:09

你们的二抗是不是新买的？如果是，你最好检查一下和你要的是否相同。我就碰到一次，公司寄的和我要的不一样，且不成套，起初一直不解，后来才发现，可试剂都快用完了

作者: 新手妈妈 时间: 2011-8-11 22:00

会不会是你们封片胶的问题啊，你用的是什么胶啊？

作者: 天涯无风 时间: 2011-9-5 12:41

复染返蓝时间太长了

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