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标题: 被烦扰很久的一个问题，求各位同行及老师提点 [打印本页]

作者: 5833001 时间: 2011-7-25 18:38 标题: 被烦扰很久的一个问题，求各位同行及老师提点

每次做出来的免疫组化片子都会有一个共同的问题，就是片子上总是局灶性或者完全性覆盖着一层灰蒙蒙的东西，不知道是什么，早期怀疑是脱蜡不完全，但是现在片子的脱蜡时间都是每缸二甲苯10分钟。。。。又怀疑过是否是滴抗体过程中组织过干燥，但是现在组织带水分湿润操作还是这样的结果，很想知道这种灰蒙蒙的物体到底是个啥，求各位老师能指导下~谢谢，问题片子如下图，MPO尤为明显的分界线，而CD38以及CD79a则呈完全性模糊不清

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作者: xkj2797xkj 时间: 2011-7-25 21:45

应该不是脱蜡不干净，也不是滴抗体过程中组织过干燥，你说说你操作步骤！

作者: 5833001 时间: 2011-7-26 00:19 标题: 回复 2# 的帖子

常规切片——烤片2小时——三缸二甲苯浓度递增脱蜡——三缸酒精浓度递减脱二甲苯——热水洗片5分钟（水温约70度）——冷水洗片5分钟——转入PBS磷酸缓冲液中洗片三次，第一次洗片5分钟，后两次洗片约3分钟——TBS工作液（ph约为6.2）高压修复2分钟——自然冷却后（一般都放在高压锅隔夜）滴加3%过氧化氢封闭内源温箱孵育（30度）10分钟——先用流水冲洗3分钟，后PBS液洗片2次，每次3分钟——开始按指标滴加一抗，温箱孵育（30度）一小时——PBS液洗片三次，每次三分钟——滴加二抗检测，温箱孵育30分钟——PBS液洗片3次，每次三分钟——DBS显色液显色约10分钟——流水冲洗2分钟——苏木素复染约40秒——温水反蓝——95%酒精，无水酒精脱水——二甲苯透明——封片

作者: dingwei 时间: 2011-7-26 07:55

1、热水洗片5分钟（水温约70度），最好不用。
2、用TBS工作液（ph约为6.2）高压修复2分钟是错误的，应该用Ph6.0的柠檬酸缓冲液修复。

作者: xkj2797xkj 时间: 2011-7-27 01:07

引用:

原帖由 5833001 于 2011-7-26 00:19 发表
常规切片——烤片2小时——三缸二甲苯浓度递增脱蜡——三缸酒精浓度递减脱二甲苯——热水洗片5分钟（水温约70度）——冷水洗片5分钟——转入PBS磷酸缓冲液中洗片三次，第一次洗片5分钟，后两次洗片约3分钟——TBS工作 ...

1、烤片两小时（建议58-60°）不知道你是多少°烤片；
2、热水洗片5分钟建议不用；
3、修复液要看抗体的修复需要，Tris缓冲液（TBS）很少用，一般都用柠檬酸缓冲液；
4、3%过氧化氢一般室温即可（其余也如此）；
5、3%过氧化氢后一般不需要用流水冲洗，直接PBS洗三次，每次3-5分钟（其余也如此）；
6、DAB显色一般在3-5分钟（镜下观察）；
7、苏木素可以稍微在长点，但不能与HE一致，苏木素染色后建议还是需要在盐酸酒精分化，在蓝化。
（纯属本人个人意见）

作者: 病理小生 时间: 2011-11-22 17:22

感觉片子拍的也不好，

作者: 王华 时间: 2011-11-22 20:15

问题解决了吗？

模糊的地方阳性信号正常表达，苏木素的颜色也与清晰的地方没有多少差异，估计是脱水透明封片的问题。
有点感觉是脱水透明时，酒精有残留，酒精可能还有水分。
你的酒精用几缸？二甲苯用几缸？多长时间更新一次？

[ 本帖最后由王华于 2011-11-22 20:23 编辑 ]

作者: 天涯无风 时间: 2011-11-25 12:43

唯一的答案：苏木素时间太短，尤其在冬天，苏木素时间应延长。

作者: boleyn1986 时间: 2011-12-4 11:16

试试复染后的脱水酒精从75%到无水酒精多加几个缸会不会好些

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