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标题: 请教：免疫组化区域不着色的原因 [打印本页]

作者: dingwei 时间: 2011-8-17 16:46 标题: 请教：免疫组化区域不着色的原因

免疫组化显色完成后，发现切片上有二区域不显色，本以为是抗体或DAB未加到，重新加一抗、二抗、DAB显色后还是没有颜色，请问大家有没有碰到类似的情况，是什么原因造成的。

作者: xiaoniou777 时间: 2011-8-17 23:22

我们也有过这样的情况，听主任分析可能与组织前期处理有关，比如固定、脱水…

作者: dingwei 时间: 2011-8-18 13:10

想不出原因：我用不脱蜡的片子、脱蜡后二甲苯不经酒精直接水洗等条件都做都过，就是无法重复做出此现象，也就是说与脱蜡过程没关系，阻断液一直是用以前配好的，也没问题，不知问题出在那。同一蜡块切的片子，其他都做得都是好的，再做也是好的，蜡块（组织前处理）也应该没问题。
是不是片子切好后碰到什么液体，把抗原破坏了？玻片上有二点强酸没洗干净把抗原破坏了？可能性也非常小。

作者: 老笨猫 时间: 2011-8-18 22:00

也发生过这样的问题，后改用全自动免疫组化仪，有改善，但并未解决。个人觉得和组织前期处理有关系。

作者: xiaoniou777 时间: 2011-8-19 17:58 标题: 回复 3# 的帖子

也就是说重做以后没有这种情况？

作者: guting2006 时间: 2011-8-19 21:09

这和脱蜡没关系，我们科也出现过这种情况，时好时坏，感觉和组织有关，致密的组织比较容易出现，还有就是抗原修复产生的气泡有关，个人感觉。

作者: shanghainese 时间: 2011-8-19 21:56

引用:

原帖由 guting2006 于 2011-8-19 21:09 发表
这和脱蜡没关系，我们科也出现过这种情况，时好时坏，感觉和组织有关，致密的组织比较容易出现，还有就是抗原修复产生的气泡有关，个人感觉。

作者: dingwei 时间: 2011-8-20 15:55

引用:

原帖由 xiaoniou777 于 2011-8-19 17:58 发表
也就是说重做以后没有这种情况？

出现白点的片子重做还是不着色。

作者: xiaoniou777 时间: 2011-8-20 21:56

那么我觉得如果是同一蜡块，别人做得好你做得不好可能是操作的问题，如果别人做的和你一样应该就是组织处理的问题。

作者: dingwei 时间: 2011-8-29 10:09

是的，关键问题是要推断操作问题出在那一步。

作者: 格言 时间: 2011-8-30 21:27

感觉是不是跟抗体有关系呢？有没有这种可能，就是在配工作液时，一抗被污染呢。

作者: dingwei 时间: 2011-8-31 07:52

不会，同一抗体同一天有十几张切片都没有此现象。如果是，在同一切片上第二次再加一抗重做，不可能不结合。

作者: xkj2797xkj 时间: 2011-8-31 20:22

是不是摊片时候有气泡或滴某液时候有气泡？

作者: dingwei 时间: 2011-8-31 20:32

摊片时候的气泡不是这样的，也不会不着色，应该是着色加深才对。
如果滴某液时候有气泡，那第二次重加会着色。

作者: xkj2797xkj 时间: 2011-8-31 21:05

如果某液滴加时有气泡，第二次再染应该是不上色de！

作者: dingwei 时间: 2011-9-2 12:00

引用:

原帖由 xkj2797xkj 于 2011-8-31 21:05 发表
如果某液滴加时有气泡，第二次再染应该是不上色de！

为什么？你有实验证明过吗？

作者: shanghainese 时间: 2011-9-3 08:36

引用:

原帖由 xkj2797xkj 于 2011-8-31 21:05 发表
如果某液滴加时有气泡，第二次再染应该是不上色de！

请您详细解释，谢谢！

作者: 大志 时间: 2011-9-3 16:29

哈哈，老革命遇到了新问题。会不会是血清的问题，不加血请试试。

作者: xkj2797xkj 时间: 2011-9-3 16:37

类似的问题我以前与迈新讨论过，结论是她们说，显色以后，如果过度，那么是不能再脱掉的（已经复染或没有复染），如果显色不够，再次显色是显不上色的（已经复染）。就此来推断，可能存在第二次重加试剂会不上色。（仅供参考有待实验证明！）

作者: dingwei 时间: 2011-9-3 21:57

你的推论是错的，我们经常把阴性的免疫组化片退了，重新加其它抗体，结果一直很好（原因是医生在诊断时开的免疫组化项目，考虑的疾变与结果不符，为了不再切片，就拿以前的片子把树胶脱了重新加一抗；或医生怀疑你抗体漏加了，重新加一次；或下面医院送来的会诊免疫组化，没有白片，只有在原来的阴性片上加其它抗体，结果都很好。只要你的抗原没有被相对应的抗体接上去就能再结合。

作者: xiaoniou777 时间: 2011-9-3 22:34

请教丁老师，如果阴性片要重加别的抗体，具体应怎么操作呢？能不能告诉我们详细的步骤？还有这样的话应该怎么收费呢？

作者: dingwei 时间: 2011-9-4 00:02

去掉玻片，用二甲苯洗去树胶，然后用酒精去二甲苯，水洗，加一抗、二抗、显色就行。
如果你觉得他的抗原修复没做好，也可以重新修复。
至于收费，应该是一样的。

作者: xiaoniou777 时间: 2011-9-4 10:47 标题: 回复 22# 的帖子

谢谢丁老师！下次我可以试试啦。

作者: 天涯无风 时间: 2011-9-5 12:48

引用:

原帖由 dingwei 于 2011-8-20 15:55 发表
出现白点的片子重做还是不着色。

很有可能是苏木素复染了以后抗原位点被覆盖了，造成阴性。

作者: dingwei 时间: 2011-9-5 13:38

引用:

原帖由 天涯无风 于 2011-9-5 12:48 发表
很有可能是苏木素复染了以后抗原位点被覆盖了，造成阴性。

苏木素不会把浆着色的位点覆盖，那怕就是有，也不会是全部。

作者: 王华 时间: 2011-9-16 19:01

我认为可能是脱蜡后过酒精速度过快或是最后一缸酒精含有少量二甲苯导致的二甲苯（或其他脱蜡剂）残留所致，脱蜡剂是脂溶性的，入水后就在组织中局部聚集，因为表面张力的原因，聚集的脱蜡剂呈类圆形，凡是残留有脱蜡剂的地方，抗体是结合不上，最后呈局部阴性表现。再加抗体也不能结合。
这样的状态是很难重复的，因为下一次做，酒精有可能换成新的了，或者过酒精的时间也有了小的变化。
我也遇到过这样的片子，很认真的比较了蜡残留（多与少）、二甲苯残留、抗体残留等原因引起的不同表现，认真的思考寻找引起不同表象的分子层面的解释。
所以最后做片子时，要做到定期更换新二甲苯和酒精，特别是酒精要勤换。如果是研究生帮做片，就规定好脱蜡脱二甲苯每缸的时间，严格执行就好了！
个人观点哦！多多指教哦！

作者: 王华 时间: 2011-9-19 18:45

回来又考虑了一下，如果在修复前有物质（如脱蜡剂或其他脂溶性物质）残留在阴性的部位，高温修复时会阻碍修复的反应，造成局部“未修复”的状态，就算修复后用甲醇阻断时将脂溶性的物质溶解了，抗原位点也不能暴露，抗体都是不能结合上去的。
有个建议：找回那张片子，彻底脱胶后，无水酒精、95%酒精浸泡10分钟后水洗，重新修复、加抗体再做一次看看能不能将阴性的部位做出来。
呵呵.......能找回那张切片吗？

作者: 王华 时间: 2011-9-19 18:47

重点是酒精充分浸泡，重新修复一次！

作者: 王华 时间: 2011-9-19 18:56

如有可能，还要问问原出片单位，他们用的组织透明剂是什么，丁老师您用的脱蜡剂是什么，两种溶剂是否互溶？
如果他们的透明剂与您的脱蜡剂不互溶，透明剂残留，用不互溶的脱蜡剂是不能去除的。
（因为我们科用的一种环保透明剂与二甲苯是不互溶的，至于其他的脱蜡透明剂之间是否互溶就不知道啦，如今环保透明脱蜡剂种类蛮多的，所以也请丁老师注意一下！）

[ 本帖最后由王华于 2011-9-19 19:00 编辑 ]

作者: dingwei 时间: 2011-9-24 10:51

第二次做就是酒精充分浸泡，重新修复，重加抗体，依然不着色。
脱蜡剂是大家都是用的是二甲苯。如果“脱蜡剂不互溶，透明剂残留，用不互溶的脱蜡剂是不能去除”，应该不只是二个小点不着色，应该是多个点甚至可能有片状、条索状出现，不过这个问题值得注意。

作者: 病理小生 时间: 2011-11-22 17:07

组织自身问题

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