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标题: 在化学层面理解“烤片” [打印本页]

作者: 王华 时间: 2011-11-2 23:42 标题: 在化学层面理解“烤片”

各位，先提几个问题（大家天天都在烤片，是否深入的想过这样的问题呢？）：

1、为什么需要烤片？

2、为什么切片的水分没烤干，染片时组织容易脱片呢？

3、如果自然晾干水分，没有经过烤片，染片时组织还是会脱片呢？

4、为什么烤片的温度低于蜡的熔解温度，组织也容易脱片呢？

5、“烤片”时产生了什么样的变化，导致组织能粘在载玻片上？

要回答以上的问题，我觉得应该在分子的层面理解载玻片的成分，组织的成分以及在烤片的过程中二者之间发生了怎样的“关系”。

载玻片的主要成分：为二氧化硅晶体，二氧化硅晶体中，硅原子的4个价电子与4个氧原子形成4个共价键，硅原子位于正四面体的中心，4个氧原子位于正四面体的4个顶角上，SiO₂是表示组成的最简式，仅是表示二氧化硅晶体中硅和氧的原子个数之比。二氧化硅是原子晶体。

组织中的成分：主要是蛋白质，糖类，核酸等极性大分子物质。

“烤片”时二氧化硅与组织发生的变化：二氧化硅的氧原子在外层，氧原子具有两对核外孤对电子，可以形成两种类型的键合力：1、氢键，氧原子与组织中的极性分子中的氢原子形成极强的偶极—偶极作用力，这种吸引力称为氢键。高温可以加速分子间的相互震动，促使氢键的形成。氢键是组织与玻片粘连的主要的力。2、配位键，氧原子外层孤对电子与组织中具有外层空轨道的阳离子形成配位键。因组织主要由C、H、O、N构成，具有外层空轨道的金属离子很少，所以配位键不是主要的结合力。

如果水分没有烤干，因为水分子是极性分子，水分子与组织中的极性分子形成氢键，阻碍组织与载玻片之间形成氢键，引起脱片。

防脱载玻片的原理就是在载玻片的表面涂一层更加容易与组织中的极性大分子形成氢键的物质（如多聚赖氨酸，侧链基团为氨基，较二氧化硅分子中的氧原子更易形成氢键），使组织与载玻片更加容易粘连，粘连得更加牢固。

基于以上原理，“烤片”有两个作用：
1、使组织与载玻片粘合。
2、加速干燥切片上的水。

原理想通了就知道如何正确烤片了：
1、烤片温度与时间：在蜡的熔解温度烤可以过夜，或65~70℃，保证水分已被烤干为度（15~20分钟）；
2、尽量晾干水分后再烤片。
如果捞片后切片下有很多水分就马上烤片，因为蜡很快熔解，水分会因为表面张力的作用在组织下聚集呈水滴，引起组织细胞结构收缩或散开，破坏组织细胞的正常结构。所以为保持组织的结构不被破坏，应晾干水分后再烤片。如果需要马上烤片，要将水分尽量甩干再烤。

个人观点，仅供参考！

[ 本帖最后由王华于 2011-11-5 10:43 编辑 ]

作者: guting2006 时间: 2011-11-4 19:26

嗯，最近也在想这个问题，刚好老师您帮我解惑了，谢谢，但是老师我还想问一问题，马上烤片和晾干后烤片（在烤片充分的情况下）哪个更容易掉片？还是差不多？谢谢

作者: llj19971997 时间: 2011-11-4 20:48

真是学习了。很佩服你，善于思考。在工作中，冰冻切片，不需要烤片就能粘在片上，而且很紧密，有人说比石蜡切片粘的还牢固。为什么呢？它的原理也像你刚才说过的石蜡烤片的原理相同吗？但是冰冻切片中组织和室温的温度差大约是40多度吧。请您再详细解释一下冰冻切片好么？

另外，我上次做免疫组化没有用防脱片，也没有脱，和涂了防脱片的感觉差不多。我觉得是不是和组织的种类有关。我做的是鼠肺的

作者: 王华 时间: 2011-11-5 11:08 标题: 回复 2# 的帖子

无论是晾干后烤片还是马上烤片，原理都是使组织与二氧化硅形成“氢键”，使组织与玻片结合。所以在“结合的牢度”上应该没有什么差异的。

但晾干后烤片与马上烤片对保持组织的形态结构方面还是有一点差异的。
请自己做个试验观察一下吧：
选大一些的组织蜡块，在一张防脱载玻片上连续捞两个组织面，切片垂直放置2~5分钟（使上一个切面干燥，下一个切面还残留有较多的水分），放在65~70℃的平面烤台上烤，同时仔细观察组织的细微变化，15分钟烤干之后染HE，在镜下再观察比较两个切面有什么差异。
无论是工作中的事还是生活中的事，都要通过自己的观察、思考、实践才能很好的理解！这是我的观点哦！

[ 本帖最后由王华于 2011-11-5 12:39 编辑 ]

作者: 王华 时间: 2011-11-5 12:33 标题: 回复 3# 的帖子

要比较石蜡组织切片与冰冻组织切片的不同，先回答几个问题吧：
一块生的猪肉和一块煮熟的猪肉，在性状上有什么差别？
一块新鲜的组织与一块固定脱水后的组织，在性状上有什么差别？
新鲜的组织是软的，具有粘性的；而煮熟的、固定脱水后的组织是硬的，没有粘性的，为什么？
甲醛固定的原理是什么？
未固定的组织与已固定的组织在分子构象上有什么差别？

   固定的目的使细胞内的蛋白质、糖、酶等各种成分沉淀保存下来，防止组织溶解。
   纯甲醛（HCHO）是一种蒸气，完全溶于水形成37%-40%的甲醛溶液，这种水溶液称为“福尔马林”。在水溶液中，甲醛先于水反应形成亚甲基乙二醇，亚甲基乙二醇与蛋白质含有氢原子的侧链反应脱掉一个水分子形成反应性羟甲基侧链（―CH2―OH）使蛋白质成为不溶性化合物而固定。
   固定前，蛋白质、脂类、核酸等大分子的分子构象是弹性可变的，所以组织是软而粘的。
   固定之后，因为甲醛分子与蛋白质分子形成羟甲基侧链交联，使蛋白质的空间三维构象失去可变性，大分子是“立”起来的。
   有机大分子之间的力决定于两个因素：氢键的数量、不同氢键（N氢键或O氢键）的吸引力。
   固定前的新鲜组织如同一个软和的糯米团，放在玻片上是“趴住的”，与玻片二氧化硅亲密接触，形成的氢键多。
   石蜡切片的组织如同一个硬了的糯米团，在玻片上是“立着的”，因为石蜡的阻碍，未烤片的组织是不能黏在玻片上的。经过烤片，大分子依旧是“立着的”，只有外层的原子能与二氧化硅形成氢键，在氢键的数量上要远远少于新鲜组织。

   基于以上理解，可以解释为何冰冻切片能牢固的黏在玻片上了。
   至于为何不用防脱载玻片做免疫组化，组织不掉片，其实是相通的道理。不同的组织的蛋白质成分是不一样的，与玻片形成的氢键数量、氢键的引力强度就会不一样。氢键数量多，引力大的组织就不会掉片，氢键数量少，引力小的组织就会掉片。建议使用防脱载玻片做免疫组化，只是确保不同组织试验的成功率。

      呵呵.......是不是觉得挺复杂的？
      如果要深刻的理解问题，都需要对问题有深层次的思考才行哦！

      个人观点，仅供参考！  请辩证引用！

[ 本帖最后由王华于 2011-11-5 12:34 编辑 ]

作者: 弦念 时间: 2011-11-5 15:58

我觉得王华老师真了不起，我在想如果当时上学时教化学的老师要是像你一样，我想我的化学一定会学的比现在要好很多！

作者: luo 时间: 2011-11-5 20:49

学习

作者: llj19971997 时间: 2011-11-5 20:55

谢谢你详细的解答，让我受益匪浅，茅塞顿开。你解释的很清楚，很有逻辑。真是佩服，很好奇你都是从哪里学来的这些东西。你的解释让我心服口服。什么时候你要是开班授课，我一定报名。

作者: 王华 时间: 2011-11-6 02:10 标题: 回复 8# 的帖子

感谢支持哦！
我的学习方法是：重新学习化学基础理论知识，在实践中使用化学的观点思考，遇到问题再重新看书寻找解决思路！

作者: 小杰 时间: 2011-11-6 18:36

学习了。

作者: flyaqmt 时间: 2011-11-7 10:30

原来道理这么多，

作者: gagawow 时间: 2011-11-10 22:46

其实一直想这个问题，但是只是想想，没有深入去好好思考。今天学习了，谢谢。

作者: dingwei 时间: 2011-11-11 07:41

这也就解释了为什么切片在经过氧化剂（高锰酸钾、过氧化氢等）处理后容易脱片的原因。氧化剂中大量的氧离子与蛋白质、氨基酸等形成氢键，导致组织与玻片脱离。

那么盐酸酒精分化不容易脱片和细胞在酒精内固定不会脱片是不是因为酒精具有弱还原性，分子中的羟基和蛋白质一起，与二氧化硅形成氢键，增加了结合强度有关？

作者: shanghainese 时间: 2011-11-11 15:23

想起了擦玻璃窗，难道玻璃窗上的灰尘也是由氢键玻璃结合的？
难怪玻璃窗很难擦干净，而且过两天又脏了。

载玻片有时很脏，要用强酸泡洗干净。是不是强酸破坏了氢键才使玻片干净了？？
载玻片不是很脏时就用酒精泡泡。酒精也能破坏了氢键？？？
但想一想又不对了，酒精要是也能破坏了氢键，那染色时rehydrate 与dehydrate时，片子岂不是都掉完了？

[ 本帖最后由 shanghainese 于 2011-11-11 23:01 编辑 ]

作者: shanghainese 时间: 2011-11-11 15:29

引用:

原帖由王华于 2011-11-2 23:42 发表
水分子是极性分子，水分子与组织中的极性分子形成氢键，阻碍组织与载玻片之间形成氢键，引起脱片。...

在染苏木素前要水洗，染色后又要水冲洗。此时极性分子水就不会与组织中的极性分子形成氢键，阻碍组织与载玻片之间形成氢键，引起脱片？？？

作者: 王华 时间: 2011-11-12 20:23 标题: 回复 14# 的帖子

先来复习一下有关化学基础：
分子间作用力指存在于分子与分子之间或高分子化合物分子内官能团之间的作用力，简称分子间力。
分子间力分子间力主要包括的类型：
一、范德华力：起初为了修正范得华方程而提出。普遍存在于固、液、气态任何微粒之间，与距离六次方成反比。根据来源不同又可分为：
1、取向力：极性分子相互靠近时，因分子的固有偶极之间同极相斥异极相吸，使分子在空间按一定取向排列，使体系处于更稳定状态。这种固有的偶极间的作用力为取向力，其实质是静电力。
2、诱导力：极性分子与非极性分子相遇时，极性分子的固有偶极产生的电场作用力使非极性分子电子云变形，且诱导形成偶极子，固有偶极子与诱导偶极子进一步相互作用，使体系稳定。这种作用力为诱导力。
3、色散力：随时产生的分子瞬时偶极间的作用力为色散力。
这3种分子间力统称为范德华力。
二、氢键：X-H…Y类型的作用力。
   氢键：氢原子与电负性的原子X共价结合时，共用的电子对强烈地偏向X的一边，使氢原子带有部分正电荷，能再与另一个电负性高而半径较小的原子Y结合，形成的X—H┅Y型的键。

   你家玻璃脏的主要原因应该是范德华力的作用：灰尘主要成分应该还是无机物，还是干燥的，所以范德华力的作用是主要的力；
   不要偷懒！经常清洁就干净啦！

   用强酸洗片子有两个作用：1、使片子上的一些有机物产生碳化；2、破坏氢键。
   用酒精洗玻片可以溶解掉一些易溶于酒精的杂质，所以玻片看起来干净了一些。但酒精是不能去“抢夺”别人的氢键的。所以用酒精洗片子是不会掉片的啦！

[ 本帖最后由王华于 2011-11-12 20:29 编辑 ]

作者: 王华 时间: 2011-11-12 20:37 标题: 回复 15# 的帖子

组织中的极性分子与玻片形成氢键后，再入水中，水分子也不能破坏已经形成的“氢键”的。
所以一般的组织水洗不会掉片的啦！前提是烤片时要充分烤干哦！

作者: 王华 时间: 2011-11-12 20:58

引用:

原帖由 dingwei 于 2011-11-11 07:41 发表
这也就解释了为什么切片在经过氧化剂（高锰酸钾、过氧化氢等）处理后容易脱片的原因。氧化剂中大量的氧离子与蛋白质、氨基酸等形成氢键，导致组织与玻片脱离。

那么盐酸酒精分化不容易脱片和细胞在酒精内固定不会 ...

高锰酸钾的反应基团是高锰酸根，具有氧化作用（MnO4－+8H++5e－→ Mn2++4H2O）；
过氧化氢会先分解成氧自由基，氧自由基有极强的氧化能力（H2O2+2H++2e－→ 2H2O）；
他们可以与组织反应，氧化组织中的羟基等基团，化学反应发生的同时，氢键就消失啦！
也许这是用高锰酸钾、过氧化氢氧化后组织容易掉片的原因吧？

盐酸酒精分化不容易脱片是因为盐酸不是很浓啊！
细胞在酒精内固定不会脱片是因为酒精只是脱水的作用，蛋白质的基团没有发生改变，容易形成氢键。

呵呵….不知对不对哦？

真喜欢大家讨论讨论，能促进思考啊！

[ 本帖最后由王华于 2011-11-12 21:40 编辑 ]

作者: shanghainese 时间: 2011-11-13 10:20

引用:

原帖由王华于 2011-11-12 20:23 发表
先来复习一下有关化学基础：
分子间作用力指存在于分子与分子之间或高分子化合物分子内官能团之间的作用力，简称分子间力。
分子间力分子间力主要包括的类型：
一、范德华力：起初为了修正范得华方程而提出。普遍 ...

我擦得是病理科的玻璃，不是我家的玻璃。

另外，单核细胞可以长在玻璃上，而淋巴细胞无法长在玻璃上。这是为什么？？

作者: shanghainese 时间: 2011-11-13 10:24

引用:

原帖由王华于 2011-11-12 20:58 发表
细胞在酒精内固定不会脱片是因为酒精只是脱水的作用，蛋白质的基团没有发生改变，容易形成氢键。
...

而石蜡切片上的组织细胞的蛋白质已经变性了。

作者: 王华 时间: 2011-11-13 18:28

能把病理科的玻璃当成自家的玻璃来擦，是关心集体的好同志！向您学习！

“单核细胞可以长在玻璃上，而淋巴细胞无法长在玻璃上。这是为什么？”以俺现在的知识水平，这个问题还真是不能回答啦！应该涉及的知识面会更多，细胞是活的，就不是简单的分子间力的作用能解释的了。俺继续学习之后，希望能知道答案！

老师不会是故意考我吧？

老师是不是有答案啊？真是急煞俺也！

“石蜡切片上的组织细胞的蛋白质已经变性了”，因为酒精是脱水性固定剂，只是与水形成氢键，将水从蛋白质分子中“拉走”导致蛋白质变性，但没有与蛋白质发生结合，所以说蛋白质的基团数量与种类没有改变，只是位置改变了。

晚辈非常喜欢与老师们相互讨论学习！如有不对之处请老师们不吝赐教啊！
感谢！感谢！再感谢！

作者: shanghainese 时间: 2011-11-14 01:06

引用:

原帖由王华于 2011-11-13 18:28 发表
能把病理科的玻璃当成自家的玻璃来擦，是关心集体的好同志！向您学习！

“单核细胞可以长在玻璃上，而淋巴细胞无法长在玻璃上。这是为什么？”以俺现在的知识水平，这个问题还真是不能回答啦！应该涉及的 ...

谢谢您！
您的回答已经很完美了。

作者: guting2006 时间: 2011-11-15 21:48

王老师的化学知识真是太强了，敬佩啊，这样的问题都能解答，向您学习

作者: dahhs 时间: 2011-11-16 09:19

佩服，佩服！

作者: ilen 时间: 2015-6-11 22:44

老师，想问个，最近我捞好片，一放烤片机，不久它就自己滑到底部了，开始是以为烤片机温度太高了，一般用75度左右，就降低了点温度，不行又以为是捞片带的水分太多了，就使命的甩水，还是有一部分下滑，现在只能认为是载玻片本身可能也有点问题，过去综合因素了，老师能帮我分析下吗？

作者: dingwei 时间: 2015-6-12 07:48

不是很明白：“酒精是脱水性固定剂，只是与水形成氢键，将水从蛋白质分子中“拉走”导致蛋白质变性，但没有与蛋白质发生结合，所以说蛋白质的基团数量与种类没有改变，只是位置改变了”。也就是说用酒精固定的组织只要放入水里或切片浸入水中，让水回到蛋白质原来的位置，蛋白质也恢复原样了，是不是这样理解？如果是这样，经酒精固定的组织入水后又变回了新鲜组织的结构？

作者: yizhonghk 时间: 2015-6-24 09:53

学习了

作者: yizhonghk 时间: 2015-6-24 09:54

学习了

作者: yizhonghk 时间: 2015-6-24 10:02

学习了

作者: 雨晴621 时间: 2015-6-25 18:20

前辈们精彩的讨论！学习领教了

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