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标题: 由苏木素氧化原理谈苏木素染液配制过程中的几个问题 [打印本页]

作者: 王华 时间: 2011-11-6 01:37 标题: 由苏木素氧化原理谈苏木素染液配制过程中的几个问题

一、苏木素的氧化反应产物

苏木素
↓
氧化苏木素（为需要的产物，染色的成分。氧化分子中一个羟基成为羰基，形成共轭π键）
↓
过氧化苏木素（其余的羟基进一步被氧化，共轭π键破坏，发色团破坏，失去颜色）

二、苏木素染液配制选用的氧化剂种类、氧化剂使用剂量。

1、常用氧化剂的比较

	半反应	氧化还原半反应和标准电极电位
氧气（O2）	O2+4H++2e－ → 2H2O	1.229
氧化汞（HgO）	Hg2++2e－ → Hg	0.851
碘酸钠（NaIO3）	2IO3－+12H++10e－ → I2+6H2O	1.195
高锰酸钾（KMnO4）	MnO4－+8H++5e－ → Mn2++4H2O	1.507

氧化还原半反应和标准电极电位值越大，得电子的能力越强，氧化力越强。
氧化能力弱的氧化剂反应速度慢，升高反应体系的温度以加快反应速度，
越强的氧化剂的反应速度越快，须控制反应体系的温度使反应速度减慢。

2、不同氧化剂的使用剂量
根据苏木素氧化反应式可以计算出氧化1克纯苏木素所需要的不同氧化剂量（理论值）。
               C16H14O6 + HgO → C16H12O6 + Hg↓+ H2O
摩尔质量 302.28    216.61
质量       1g       0.72g
               6C16H14O6 + 2NaIO3 → 6C16H12O6 + I2 +6 H2O + 2Na+
摩尔质量 302.28×6 197.9×2
质量       1g             0.2g
               4C16H14O6 + KMnO4 → 4C16H12O6 + 4H2O + Mn2+ + K+
摩尔质量 302.28×4 158.03
质量       1g             0.13g

注意：这是理论值，在实际配制染液时，氧化剂的使用量要减少至理论值的1/2量为宜。
理由：
（1）、我们使用的氧化剂品质多为分析纯的，含量比较保证，而苏木素为天然染料，含量不是很保证，所以氧化剂需减少用量。
（2）、配制染液时应刻意保留1/3量的苏木素不被氧化，使之在使用过程中再被氧化，令染液耐用。

三、媒染剂的使用
氧化苏木素羰基中的氧原子最外层轨道含有孤对电子，能与Al3+++、Fe3+++等金属离子形成外轨型配合物。氧化苏木素通过金属离子与细胞核内DNA双链外侧磷酸基上带有孤对电子的氧原子形成配位键而使细胞核内的DNA着色。媒染剂的使用不但大大提高了氧化苏木素对DNA的上染率，也加强了染液的水洗牢度。
媒染剂一般为二价或三价金属的盐或氢氧化物。
常用于苏木素染液配制的媒染剂为KAl(SO4)2·12H2O、FeK(SO4)2·12H2O、NH4Fe(SO4)2·12H2O等，也可以用其他的如Al2(SO4)3·18H2O、AlCl3·6 H2O、FeCl3·6 H2O等可电离Al3+++ 或Fe3+++的盐作为媒染剂。

四、乙酸的使用
冰乙酸的作用是降低苏木素染液的PH值，增强DNA着色的特异性，减少蛋白质的非特异性着色。
蛋白质分子具有游离的氨基端与羧基端，为两性分子。溶液的PH值高于蛋白质的等电点时，蛋白质羧基端电离时负电，与氧化苏木素的Al3+++ 结合，引起蛋白质的非特异性染色。当溶液的PH值低于蛋白质的等电点时，蛋白质的羧基端不电离，而氨基端以阳离子形式存在，与Al3+++相斥，氧化苏木素不能与蛋白质结合，减少蛋白质的非特异性染色。

[ 本帖最后由王华于 2011-11-6 10:33 编辑 ]

作者: 王华 时间: 2011-11-6 01:45

五、苏木精染液常见问题的原因分析及解决方法

1、苏木精染液表面“氧化膜”与沉淀的形成
苏木精染液表面的氧化苏木精与空气中的氧气接触而进一步氧化，氧化苏木精3位羟基被氧化成羰基，羰基氧原子的孤对电子充分暴露在外，更容易进入Al3+++ 的杂化空轨道形成配位键，使过氧化物形成聚合物。苏木素染液表层过氧化物氧聚合物成片层样，形成“氧化膜”，溶液内部的过氧化物聚合物形成沉淀。

解决办法：
（1）、避免氧化反应过度引起过氧化苏木精增多。
（2）染液加入丙三醇：丙三醇俗称甘油，丙三醇1、2、3位均连有一个羟基（极性基团），羟基中的H原子带部分正电荷，与氧化苏木精分子中的羟基上的O原子（带部分正电荷）形成氢键。丙三醇分子占据了氧化苏木精的羟基旁的位置形成“空间阻隔效应”，有效阻断了Al3+++ 与O原子形成配位键，使氧化苏木精分子不能聚合，减少了沉淀和“氧化膜”的产生。

2、苏木精染液染色能力下降过快。
苏木精染液染色能力下降的原因：
（1）苏木精染液在使用过程中，因染液中的氧化苏木精浓度逐步降低导致的染色颜色变淡，此属正常现象。
（2）染液中的氧化苏木精进一步被氧化成过氧化物，过失去染色能力。
根据化学反应平衡原理及化学反应速率理论，苏木精染液配制时，反应物浓度逐渐下降，生成物浓度逐渐增加，氧化反应达到了初步的平衡。但在反应体系中依旧存在低浓度未反应的氧化剂离子（Hg+、IO3－等），在染液使用过程中，染液中的氧化剂继续缓慢的进行氧化作用，使染液中的氧化苏木精苏木精进一步被氧化。
染色过程中将自来水带入苏木精染液也是形成过氧化物的重要原因：目前，我国自来水消毒剂常用Cl2 （1L水中通过0.002g Cl2）。Cl2 与水反应生成HClO，ClO－具有很强的氧化能力，将氧化苏木精继续氧化成过氧化苏木精，加速染液“变旧”。

使苏木素染液耐用的方法：
（1）配制过程中氧化剂的使用量要合适：氧化剂的使用量要减少至理论值的1/2量为宜。目前生产苏木素的厂家很多，苏木素的纯度高低不一。需根据苏木素的质量适当调整氧化剂的使用量。配制结束时染液中依旧存在一定浓度的苏木素未被氧化，以“应付”染液在放置和使用过程中氧化剂的继续氧化反应，尽量减少染液中的过氧化苏木素的生成。
（2）配制过程中对温度和反应时间的控制要合适。HgO的最佳反应温度为90~100℃反应5分钟后快速冷却，NaIO3，KMnO4在室温下（25℃）进行氧化反应，如果温度过高，氧化反应将会过快，苏木素被直接氧化成为过氧化物，导致具有染色能力的氧化苏木素浓度低下，导致染色效果差。
（3）染色过程中减少自来水带入染液。进入苏木素染液前用蒸馏水洗切片或将自来水尽量甩干再放入染液染色，可有效延长苏木素染液的使用寿命。

在各种病理技术参考书中提到的配制苏木素染液的方法繁多，各个病理科也有根据自己的经验进行改良的方法。其实只要掌握了苏木素氧化的原理，各种氧化剂的氧化能力强弱，无论用何种方法，都能配出好用、耐用的苏木素染液！

个人观点，仅供参考！

[ 本帖最后由王华于 2011-11-6 01:59 编辑 ]

作者: 王华 时间: 2011-11-6 01:48

非官方公布一下我配制苏木素染液的方法：

十二水硫酸铝钾30克  蒸馏水450ml，稍加热溶解，冷却至室温。
2克苏木素粉剂、30ml无水酒精  加热溶解后与冷却的硫酸铝钾溶液混匀，
加入0.2克碘酸钠搅拌2分钟使之溶解，室温静置4~12小时，
捞除表面氧化膜，加入25ml冰乙酸、25ml甘油，搅拌均匀即可使用。
也可多配一些装瓶保存备用。

如果苏木素粉剂质量差，减少碘酸钠的量至0.08克/1克苏木精。

   优点：方便、安全、耐用！
      不同的人操作得到相同的效果，重复性好哦！

[ 本帖最后由王华于 2011-11-6 01:59 编辑 ]

作者: 梅花 时间: 2011-11-6 22:21

王华老师，你对苏木素的配制分析得非常透彻，真让我受益非浅！

作者: flyaqmt 时间: 2011-11-7 09:59

学习

作者: juefei 时间: 2011-11-8 22:43

请教苏木素用时间长了会出现氧化膜吗？谢谢！

作者: 王华 时间: 2011-11-8 23:59

用久了甘油的浓度下降，氧化膜就会渐渐增多，可以补充一些甘油缓解。

作者: dingwei 时间: 2011-11-9 07:56

使用甘油也有一定的付作用，象肠粘膜容易出现非特异性染色。如果工作量大的单位，苏木素更换较勤，配好的苏木素在一二个月内用完，一般不要使用。

作者: 王华 时间: 2011-11-9 12:42

使用甘油的优点是能有效的减少氧化膜，过氧化物沉淀污染切片；缺点就如丁老师说的，容易出现非特异性染色，特别是在一些含黏液多的组织中更加容易出现，如肠粘膜上皮，产生粘液的肿瘤等。
我来分析一下原因吧：
甘油，又称丙三醇，含有三个羟基，三个羟基伸向三个不同的方向。羟基上的氧电负性远远大于氢，导致电子云向氧偏移，氢原子几乎变成裸露的质子而具有大的正电荷场强，因而这个H原子能与另一个电负性大、半径小并在外层有孤对电子的原子（O、N、F等原子）产生定向的吸引力作用，形成氢键。
甘油可以与氧化苏木精分子的羟基、羰基上的氧形成氢键，所以能有效阻碍氧化苏木精、过氧化苏木精之间的聚合，使沉淀减少。
甘油也可以与蛋白质分子的外层侧链基团（-NH3、-COOH、-OH）中O、N的形成氢键，甘油的又同时与氧化苏木精以“氢键”相连，通过甘油这个“分子桥梁”，自然就增加了氧化苏木精与蛋白质的“粘连”，形成非特异性染色。而富含粘液的组织，含有大量的粘多糖。糖类从化学结构讲它们是一类多羟基醛或酮，或能水解为多羟基醛或酮的化合物，含有大量羟基、醛基、羰基。糖类与甘油形成的氢键就比蛋白质更多，更容易形成苏木素非特异性染色。
苏木素分子上的羟基也能与蛋白质、糖类形成氢键连接，只是数量为1:1，而甘油介导的为1:2；连接的苏木素的量增多了。而甘油的分子体积远远小于氧化苏木精分子，所以更加容易在一些空间位置小的地方也形成氢键连接。
这就是我理解的苏木素非特异性染色和甘油使非特异性染色更明显的原因。
如果理解了道理，就知道什么是解决问题的关键：染过苏木素染液后如何有效破坏甘油的“氢键”吸引力，使非特异性粘连在蛋白质、糖类分子上的氧化苏木精分子洗脱掉。
解决方法：稍微加大分化液的酸度，配成1.5%盐酸酒精，用50%酒精配制。要注意分化液的更新，保持分化活性。
原理：酸根H+是一个裸露的质子，与甘油的羟基上的氢原子形成有力竞争，使氢键引力消失。氢键消失了，苏木素分子就脱离蛋白质分子或糖分子了。其实这个分化甘油原理与分化苏木素的原理是同理的。

其实要做好HE染色切片，组织固定、脱水、苏木素染液的配制与HE染色过程是需要“一体化”配合的。
凡事都有利弊，无非是使“利”尽量最大化，使“弊”最小化而已。
用得好不好，关键是深刻的理解！考虑问题越全面，就越明白如何协调各种因素，做得更好！

丁老师，这是我个人的观点，可能也不是很全面，请丁老师批评指正！

[ 本帖最后由王华于 2011-11-9 12:44 编辑 ]

作者: juefei 时间: 2011-11-9 23:03

今天又上了一课。谢谢两位老师！！

作者: 小平平 时间: 2012-2-4 23:15

今天才看到不好意思！少逛我们的论坛！

作者: shanghainese 时间: 2012-2-5 13:11

不知楼主对苏木素的替代物有无研究?

作者: ilen 时间: 2015-6-11 22:30

谢谢老师的讲解，我们科室现在用老师的染色法，一些小问题一直都不知道是为什么，现在豁然开朗了，还是手法和认识上出错，下次配置再仔细看看，非常感谢

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