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标题: 为何我的小鼠肝脏ＨＥ染色如此奇怪？——胞核周围胞浆仿佛完全脱失？急救！ [打印本页]

作者: doctor_wang 时间: 2012-1-25 06:17 标题: 为何我的小鼠肝脏ＨＥ染色如此奇怪？——胞核周围胞浆仿佛完全脱失？急救！

诸位高手，
　　我最近在作小鼠的组织切片，protocol 如下：
肝脏标本：1)
１０％中性福尔马林固定三日左右
2) 流水清洗标本半小时至１小时
脱水：
　　70%酒精　２小时
　　80%酒精　１小时
　　95% ethanol I 1 hr
95% ethanol II 1hr
100% ethanol I 1hr
100% ethanol II 1hr
二甲苯xylene I 40min
　　　Xylene II 40min
石蜡　paraffin plus I 1hr
　　　paraffin plus II 1hr
　以上脱水透明浸蜡液体温度均为６０度水浴箱中进行。
包埋　embeding
切片　４４度水浴展片
　　　　４０度烤片４小时
ＨＥ染色：脱蜡至水后，
用Mayer's Hemotoxylin 染核　１０ｍｉｎ，流水洗１０ｍｉｎ返蓝。无分化过程。
　　醇性eosin 染胞浆
　　９５％，１００％ethanol, xylene透明后封片。
问题：肝细胞核周胞浆仿佛脱失一样，无法着色。类似空泡变性？让人无法理解。尝试过更长时间的脱水透明等，均无明显改善？
　　问题出在：切片前的脱水透明出了问题？ＨＥ染色有问题？
十分苦恼！已经一个多月了，尝试过很多方案均无明显改善。恳请各位高人献计献策！祝各位新年如意！

作者: doctor_wang 时间: 2012-1-25 06:19 标题: 继续传低倍镜

继续传低倍镜

作者: doctor_wang 时间: 2012-1-25 19:12 标题: 会不会是脱片的一种特殊形式？问题出在烤片？

作者: shanghainese 时间: 2012-1-26 14:13

这是动物实验模型的小鼠肝脏吧？
正常对照组的小鼠肝脏切片的细胞形态如何？

作者: doctor_wang 时间: 2012-1-26 15:30 标题: there are both the normal slices in the 1st and 2nd floor.

there are both the normal slices in the 1st and 2nd floor. all the slices present so strange shapes no matter control or experiment group.

作者: doctor_wang 时间: 2012-1-26 15:32 标题: ４０度烤片, sometime 30min , sometime 4hr.

作者: shanghainese 时间: 2012-1-27 13:11

固定之前组织是否新鲜?
固定时是将整个肝脏固定,还是分切之后固定?
固定液与组织的体积比率是多少?
固定的温度是多少?
其他组织是否也有这种现象?

作者: doctor_wang 时间: 2012-1-29 21:44

再次感谢您的指点。您是怀疑固定环节出现了问题。
我的固定是超出1:4比例的固定。因为常常仅能获得小鼠肝脏的一半甚或四分之一，所以每个样品均是固定于２０ｍｌ１０％中性福尔马林液中的小杯中的。
组织是一旦获得，立即投放于固定液中的，但是作石蜡块时常延后至半月以后，大多是在固定半月以上才来作石蜡切片的。但是新鲜的标本也不行。不知道为何？？胃肠要好些，组织胞浆脱失失色的现象少见。我作了７个批次，每次近乎１５个蜡块，仅有一个批次的蜡块效果较好。不知道是什么原因？？为此多次延长固定脱水时间均　不见效。唯一作的不大到位的是烤片。我的烤片时间大多十分不规律，多数３７度１～４小时，也试过６０烤片，发现片子上的石蜡几乎完全融化，不知道是否对组织着色以及后续的免疫组化有影响。肯定大家再次指点。

作者: doctor_wang 时间: 2012-1-29 21:51

您觉得还有那些环节出问题呢？
这中细胞核周边的脱色是否是一种特殊类型的脱片呢？是否与ＨＥ染色过程相关呢？？出问题的环节在那一步呢？

作者: doctor_wang 时间: 2012-1-29 21:52

我的所有石蜡块，均是在－２０度冰箱冻存数小时至１２小时的。

作者: ChenRong 时间: 2012-1-29 23:46

这个和固定的关系比较大点，试着将组织切薄后固定，或是固定液是否对。
还有你试试不要放在60度的水浴箱里来脱水，或是降低到35度来试试。

作者: ChenRong 时间: 2012-1-29 23:50

还可以试试不熬流水冲洗直接脱水
你蜡的熔点是多少？

作者: shanghainese 时间: 2012-1-30 00:33

引用:

原帖由 doctor_wang 于 2012-1-29 21:44 发表
再次感谢您的指点。您是怀疑固定环节出现了问题。
我的固定是超出1:4比例的固定。因为常常仅能获得小鼠肝脏的一半甚或四分之一，所以每个样品均是固定于２０ｍｌ１０％中性福尔马林液中的小杯中的。
组织是一旦获得 ...

也许您拿到组织时已经不新鲜了.

作者: ChenRong 时间: 2012-1-30 09:53

用防脱片做的试试吧，如果做的效果好的话，可以排除固定的问题。
你的片子做的怎么弄出个（透明细胞），你厉害的

作者: doctor_wang 时间: 2012-1-30 22:03

I always used the adhensive slides, superPlus , for preventing tissue drop off the slides. and all the processing is under temperture excluding the paraffing and embeding in the 60 centigrade.
and I wonder if the key factor is in the H&E staining process? Fixation? drying the slice?
I am eager for your advice!

作者: ChenRong 时间: 2012-1-30 22:19

英文看的好累啊，你的意识是你用了防脱片？H&E staining process? Fixation? drying the slice?
你说的这几个都有可能。所以一个个排除，用了防脱片还是这样的话，基本可以说是固定的问题了

作者: doctor_wang 时间: 2012-2-1 06:33

对不起，实验室的电脑没有中文操作系统。我试过室温下进行脱水处理，也试过各种烤片方法。目前看来可能问题出在固定上，因为我们都是使用一个１５ｍｌ的Ｓｉｇｍａ公司的中性福尔马林溶液的小杯子。并没有应用大容器。然后就是将修剪的新鲜肝脏组织（通常是半肝）予以投入杯子，肉眼估计体积比１：７左右。一直浸泡，不换液。直到我们要开始作石蜡块了，通常是半月后。因此，有可能存在像您所说的，固定不充分，部分自溶了。但是我看临床病理科，常常很大的标本，也就装在一个比标本体积大一倍的标本袋中，也就装入等体积甚或更少的固定液在里面，一样在临床上在作ＨＥ及组化。好像病理科也没有提什么意见。所以我现在也不能很肯定是哪方面的问题。

作者: doctor_wang 时间: 2012-2-1 06:35

我的石蜡是sigma公司订的, paraffinPLUS，里面加有些高分子聚合物。熔点是52~58度左右。

作者: doctor_wang 时间: 2012-2-1 06:37

烤片，你们都是６８度烤片吗？那样石蜡一般都很快就融化了是否不好。我都是４０度烤片。我用的是带正电荷的SuperPLUS防脱片的载玻片。

作者: ChenRong 时间: 2012-2-1 08:35

这样，你可以拿到你附近病理科去让他们按照他们的方法做一下。

作者: doctor_wang 时间: 2012-2-2 20:50

多谢解答，我现在准备将标本再切小点，以改进固定。然后再试试。多谢！！我用的是带正电的防脱片。

作者: shanghainese 时间: 2012-2-3 12:09

能否告诉我们你使用的fixation buffer 是哪家公司的, 和catalog number.

作者: doctor_wang 时间: 2012-5-11 19:08

多谢各位老师的指点。目前问题已经基本解决。核心是改善了固定。果然在将组织块切薄，增加固定液的体积后，效果立即明显改善。

作者: ddyyff559 时间: 2012-5-12 01:32

实践出真知！学习了

作者: histotechnology 时间: 2012-6-8 08:04 标题: 回复 1# 的帖子

正常结构，没有禁食的肝脏都是这样

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