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标题: 老问题重问： [打印本页]
作者: zangtl    时间: 2012-9-20 09:54     标题: 老问题重问：

老问题重问，同一张切片一半染色蓝偏重，一半正常是为什么。请教大家。。
作者: 老笨猫    时间: 2012-9-20 18:54

你是不是酒精出来直接吹干的
作者: 老笨猫    时间: 2012-9-20 18:56

伊红染色时间是不是很短
作者: 病理爱好者    时间: 2012-9-20 21:57

可能是苏木素里冰醋酸加多了而造成染色不均匀。
作者: zangtl    时间: 2012-9-22 09:37

谢谢大家，我再试下
作者: 小钟    时间: 2012-9-27 22:23

我觉得是你染完苏木素返蓝后流水冲洗时间不够，导致伊红上色不均匀
作者: wuhuanziyu    时间: 2012-9-28 19:47

还有脱蜡是否充分，如果脱蜡不彻底，也有可能造成伊红染色不均
作者: 王华    时间: 2012-9-28 21:06

用什么做返兰液？饱和碳酸锂还是氨水？
作者: jensen0901    时间: 2012-10-11 23:30

请问王华老师，饱和的碳酸锂和氨水反蓝的差别？一直听王华老师都是从分子基础去研究病理技术，望指点一下。
作者: ChenRong    时间: 2012-10-12 08:52

照片有哇，好像跟脱蜡有点关系，一半一半又不像了，又或许和切片厚度有关，厚薄不均，也不太像，又好像和苏木素不够，一半没有浸润到位似的，想想你也不太会这样干。看看照片吧

[ 本帖最后由 ChenRong 于 2012-10-12 08:54 编辑 ]
作者: 王华    时间: 2012-10-14 11:48

常规HE染色使用氨水或饱和碳酸锂溶液进行返兰，是利用两种溶液的碱性。
    苏木素是苯并吡喃类生物染料，这种染料在不同的PH之中呈现不同的颜色，酸性时为红色，中性时为紫色，碱性时为蓝色。
    苏木素染液中加入冰乙酸用以减低非特异性染色，呈酸性；之后的分化液含有盐酸，呈酸性；
    所以染完苏木素分化后进行一步“返兰”，就是用碱性溶液中和掉组织中的酸性，使苏木素呈现蓝色。如果不用氨水、碳酸锂溶液返兰，用温水、流动自来水浸泡时间长一些也能去除组织中的酸性，使苏木素返兰。
    返兰之后要充分将组织中多余的碱性溶液充分洗净，因为残留的碱性溶液会影响伊红的着色。
    伊红是通过伊红分子中的羧基电离后带负电，与蛋白质中带正电的氨基端或侧链氨基（-NH4 ）结合，使蛋白质染色。
    如果碱性溶液在组织中残留，蛋白质是两性化合物，在碱性环境中，蛋白质就出现羧基端电离呈负电，氨基端不带电，整个蛋白质分子呈负电。伊红是负电，蛋白质是负电，负负相斥作用，伊红就染不上了。
    在返兰后清洗的实际操作中，容易出现的现象是碱性返兰液清洗不彻底，组织局部碱残留，就呈现出同一片组织内局部红局部不红的现象了。

    尽管氨水和饱和碳酸锂都能达到返兰的目的，基于这两种物质不同的化学性质，这两种溶液在使用过程中还是有一些差异的。

    氨（NH3）：  易溶于水成为氨水（NH3H2O,也称氢氧化铵），氨水具有强碱性。氨的分子结构：NH3，N原子为不等性sp3杂化，4个杂化轨道中的3个 分别与H原子形成σ键，整个分子呈三棱锥形结构，N原子的另一个sp3杂化轨道被一对孤对电子占用，位于棱锥形的顶端。

    碳酸锂（Li2CO3）：强碱弱酸盐，具有碱性。1g溶于78ml冷水。

    碳酸锂在水中的溶解速度比氨水要慢，所以返兰后浸泡清洗的时间要稍长一些。无论哪种返兰液，都要保证清洗干净。个人经验：冷水浸洗3次，每次1分钟。第2第3次可以用40度左右的温水清洗，可以缩短时间，效果不错。
    N的电负性是3.05，并且氨基有一对孤对电子， 使得氨基中的N极易与蛋白质中的H形成氢键。氨基这个特性引起组织中蛋白质的二级三级构象发生改变，导致蛋白质出现“松解”的现象。组织与载玻片粘连，组织与载玻片形成氢键起到重要作用。氨可以破坏组织与载玻片的氢键，使组织与氨形成氢键。这也就解释了为什么用氨水进行返兰，组织容易掉片的原因。

    基于氨基这样的特性，有兴趣的同志们可以思考一下，为什么在免疫组化修复液中使用EDTA修复液的修复效果要强于柠檬酸修复液，为什么PH值越大的修复液修复效果越强？

同志们，化学是基础啊！有时候是可以达到“一通百通”的效果的……

个人观点，希望大家辩证看待！

[ 本帖最后由 王华 于 2012-10-14 11:51 编辑 ]
作者: 盼盼    时间: 2012-10-14 16:58

学习了。王华老师的讲解太好了，希望能多听到这样的分析和讲解！
作者: 陌路行客    时间: 2012-10-25 13:37

受教了，多谢指点
作者: jensen0901    时间: 2012-11-7 10:06

王华老师讲得好，化学的确是一门很好的学科，关键是你的态度，我佩服。关于高的PH值EDTA修复液的修复效果更好，可能就是仁者见仁智者见智了，但是PH值越高，背景染色也会越重，每种抗体得分别处理，这是一个量大的工程，还得继续努力才行。
作者: zyc921115    时间: 2012-11-7 13:17

我也不知道。。。还没遇见。。。
作者: 秋影无声    时间: 2012-12-1 18:06

王老师分析的太到位了。受教
作者: fangqingquan    时间: 2012-12-29 13:31

王华老师对常规HE染色原理分析得很透彻，学习了！
我们也曾出现一片组织内局部红局部不红的现象，后来也发现原因是返兰后碱性返兰液清洗不彻底，现在问题解决了。
不过1#问的是“同一张切片一半染色蓝偏重，一半正常是为什么”，我觉得有可能是切片厚薄不均的缘故。



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