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标题: [转帖]再问有关一抗稀释的问题? [打印本页]

作者: 好好    时间: 2003-5-19 15:18     标题: [转帖]再问有关一抗稀释的问题?

用于稀释一抗的PBS中加入Triton-100,请问各位前辈Triton-100的浓度是多少?是0.4%?0.3%?国产和进口是否有区别?
作者: 好好    时间: 2003-5-19 20:36     标题: [转帖]再问有关一抗稀释的问题?

对不起,我打错了,是Triton X-100。
盼丁老师等前辈给予解答!
作者: dingwei    时间: 2003-5-19 21:07     标题: [转帖]再问有关一抗稀释的问题?

你说的二种浓度都可以。
作者: shanghainese    时间: 2003-5-22 23:49     标题: [转帖]再问有关一抗稀释的问题?

好好 :
If you are doing brain IHC staining, I recommend you using 0.1% Saponin.  It is much better than 0.2% Triton X-100 and less background.  It is not necessary adding these kind detergents with primary antibody.  You can incubate brain section with them before add primary antibody.
作者: 好好    时间: 2003-5-25 16:12     标题: [转帖]再问有关一抗稀释的问题?

丁老师、shanghainese 老师好:
我在做脑缺血方面的课题,现在需要做脑片的免疫组化。用冰冻切片,对于一些细节问题我一直都弄不懂。受经济条件限制,我采用下步骤,请你们帮我看看,可行吗?
             (冰冻切片)-20C 丙酮固定20 min
                  0.01 M PBS洗3次,5 min/次
                       3%H2O2甲醇,15 min
                  0.01 M PBS洗3次,5 min/次
                             5%羊血清30 min                              
                           一抗,4C 过夜
                0.01 M PBS洗3次,5 min/次
                           二抗,37C 1小时
                0.01 M PBS洗3次,5 min/次
              DAB显色(显微镜下控制显色时间)
           视情况决定是否苏木精衬染,分化,蓝化
                          脱水,透明,封片
一抗、二抗均用PBS稀释,结果有个通病,背景色太深,加入Triton X-100好象没有太大效果。该如何处理,是否稀释一抗的PBS中加入1%皂甙会消除,是否有其他办法?

作者: dingwei    时间: 2003-5-25 20:46     标题: [转帖]再问有关一抗稀释的问题?

关键是用的是什么抗体,有的一抗(特别是科研用的)背景很黄,一点也没办法。
作者: shanghainese    时间: 2003-5-25 22:20     标题: [转帖]再问有关一抗稀释的问题?

好 好 :你 好!
我 不 知 你 用 的 是 什 么 抗 体 , 什 么 克 隆,从 什 么 地 方 买的,很 难 给 你 好 的 建 议。不 过 你 可 试 下 稀 疏 一 抗 不 同 的 浓 度。
另 外 我 不 明 白 你 用 了 丙 酮 固 定,为 何 还 用 Triton X-100?不 妨 试 试 不 用 Triton X-100 。

作者: 好好    时间: 2003-5-26 21:53     标题: [转帖]再问有关一抗稀释的问题?

丁老师、shanghainese 老师好:
我的课题主要是做5-脂氧酶(5-LO)的表达,不知你们可知道或做过?抗体定出很长时间,可还没到货。
这期间,我做过NR1、VEGF、GFAP。NR1是自己实验室生产的,表达较多。VEGF是北京中山提供的Santa Cruz产品,在脑片上我一直做不出来,试过不少方法,不知道原因在哪儿?GFAP也是北京中山的,是多抗(便宜些),有表达,但不如别人(主要是老外)文献上的好看。是否用单抗会好些?
对于你们的帮助,深表感谢!

作者: 高山流云    时间: 2003-7-26 09:18     标题: [转帖]再问有关一抗稀释的问题?

背景染色深应考虑一抗的稀释度的问题,可多试几个浓度. 用了丙酮就不要用TritonX-100了,它们都有细胞膜打孔的作用.
作者: 好好    时间: 2003-8-1 20:59     标题: [转帖]再问有关一抗稀释的问题?

谢谢!
我一直以为丙酮是起后固定的作用,不知其有与TritonX-100同样的作用。我试一下降低一抗的浓度。
作者: pathypmh    时间: 2003-8-6 20:59     标题: [转帖]再问有关一抗稀释的问题?

稀释试剂的缓冲液不要加TritonX-100,那个只是做洗涤用,比如还有加土温的等。
脑的免疫组画,建议用浓甲酸处理组织切片2小时后,再进行以后的操作
作者: 好好    时间: 2003-8-6 21:30     标题: [转帖]再问有关一抗稀释的问题?

楼上好!
  我有些糊涂了。
  我认为是应该在稀释抗体的缓冲液中加TritonX-100。我做的是冰冻切片,您所说的“浓甲酸处理组织切片2小时”是否适用?我真没听说过。
  希望各位大师给予指点迷津!




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