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标题: 请教丁老师及各位前辈 [打印本页]

作者: 妙手仁心2008 时间: 2003-7-30 19:48 标题: 请教丁老师及各位前辈

丁老师：
您好！我用TUNEL法检测原位细胞凋亡情况，试剂盒是德国宝灵曼的，碱性磷酸酶/bcip（nbt）显色系统。结果应该是只要凋亡细胞着色，可我做的结果是很多细胞核与核膜均有着色。不知道是试剂有问题，还是我的方法上有问题？我把我的方法介绍一下，请大家指点指点，谢谢！
1）切片常规脱蜡、水化。（2）PBS（PH7.4）冲洗3次，每次5分钟。（3）加入20μg/ml蛋白酶K，温盒内37℃下消化30分钟。（4）PBS冲洗3次，每次5分钟。（5）加Tunel液（I液和II液按1：9混合而成），阴性对照片仅加II液，温盒内37℃下孵育60分钟。（6）PBS冲洗3次，每次5分钟。（7）加荧光素抗体，湿盒内37℃下孵育30分钟。（8）PBS冲洗3次，每次5分钟。（9）加入新鲜配制的BCIP/NBT，显微镜下观察显色30分钟，自来水冲洗。透明、中性树胶封片。

作者: 临风揽月 时间: 2003-8-1 09:59 标题: 请教丁老师及各位前辈

个人感觉是蛋白酶消化时间没有控制好！

作者: pathypmh 时间: 2003-8-6 21:22 标题: 请教丁老师及各位前辈

宝灵曼公司的试剂啊，呵呵，有钱啊！
我用宝灵曼公司的试剂做过mRNA原位杂交。感觉他们的试剂价格昂贵，但质量上是很优质的，但是成功的关键在于取材和组织处理这开始的几步上面。
你能把你开始的几步贴出来吗，还有，你的是什么组织
另外，原位杂交的洗涤是很重要的，你试试用SSC洗涤（你是什么代理那里买的啊，你的方法似乎很不规范呢）

作者: dingwei 时间: 2003-8-13 21:20 标题: 请教丁老师及各位前辈

最近我也刚买了一个德国宝灵曼的TUNEL法检测原位细胞凋亡试剂盒，结果也是有很多细胞核着色，不知是不是试剂盒的问题还是蛋白酶K没处理好。我试了很多片子和消化时间，还是这样。

作者: 妙手仁心2008 时间: 2003-8-15 18:21 标题: 请教丁老师及各位前辈

丁老师
还想问您，不知您在加tunel反应液后，有没有用荧光显微镜观察，结果与您染色后的结果有没有不同？那么现在依您的考虑我该怎么办呢？请您指导，我很彷徨啊！！！

作者: 冰雪 时间: 2003-8-15 20:17 标题: 请教丁老师及各位前辈

丁老师：不知你是做石蜡还是冰冻切片？若是过氧化物酶标记，我认为减少非凋亡细胞的强染色应从几个方面考虑：
1.做石蜡切片固定剂，应4%多聚甲醛溶液（溶于pH7.4PBS中）固定，固定后应24小时流水冲洗，最好低温蜡包埋
2.阻断溶液：0.3%H2O2甲醇溶液
3.蛋白酶K消化时间不应太长
4.转化剂-POD应用100mM Tris-HCI，150Mm NaCl pH7.5以1：2—1：5稀释。
5.增加冲洗次数
6.DAB最好自己配置，最终浓度0.025%，显色时间可延长。
以上只是本人小建议，不知对你是否有帮助。

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