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标题: 合理应用二步法免疫组化检测系统 [打印本页]

作者: dingwei    时间: 2002-8-14 23:57     标题: 合理应用二步法免疫组化检测系统

[这个贴子最后由dingwei在 2002/08/15 00:09am 编辑]

                     合理应用二步法免疫组化检测系统

二步法免疫组化染色技术,由于其背景低,操作简便,近几年被广泛应用。我们对几家公司的两步法免疫组化检测系统进行比较,确定不同检测系统对不同的抗原的表达特异性。
一、方法和结果
1、检测系统的选择
(1)、DAKO公司出品的EnVison检测系统
(2)、NICHIREI公司出品的N-Histofine检测系统
(3)、Antibody公司出品的Two-Step检测系统
(4 )、Zymed公司出品的超强型PV6000检测系统
2、组织的选择
   2002年我科常规肿瘤标本,包括多种上皮性肿瘤、间叶性肿瘤、神经内分泌肿瘤、淋巴瘤。
3、抗体的选择
核表达:ER、PR、P53、Ki-67
膜表达:C-erbB2、CD3、LCA、CD20、CD30、CD79a、CD45RO
浆表达:CK、EMA、S-100、CGA、NSE、Syn、PS2
    以上均选用单克隆抗体。
4、操作方法
组织切片常规脱蜡至水;TBS洗;用0.3%甲醇双氧水阻断内源性过氧化物酶(15分钟);TBS洗;高压抗原修复(带帽出气后3分钟,立即冷却);TBS洗;正常山羊血清封闭(15分钟);滴加相应的抗体(每种抗体滴加3张相同的切片)(37℃,60分钟);TBS洗;对每一种抗体相应滴加3家公司的检测系统37℃,60分钟);TBS洗;DAB显色;苏木素复染;脱水透明封固。
5、结果(见附表1)
附表1
抗体名称 工作浓度  DAKO  NICHIREI  Zymed  Antibody
ER        1:150    ++     + ~ ++    +++   +++
PR        1:150    ++     + ~ ++    +++   +++
P53       1:100    ++     + ~ ++    +++   +++
PS2       1:300    +++    ++        ++    ++
C-erbB2   1:150    +++    +         ++    ++
LCA       1:150    +++    + ~ ++    ++    ++
CD20      1:150    +++    +         ++    ++
CD45RO    1:150    +++    + ~ ++    ++    ++
CD3       1:60     +++    +        + ~ ++ + ~ ++
CD30      1:50     ++     +        +~ ++  +~  ++
CD79a     1:80     +++    + ~ ++   ++     ++
CK        1:150    +++    ++ ~ +++  +++   +++
EMA       1:150    +++    ++       +++    +++
S-100     1:800    +++    +++      +++    +++
CGA       1:1500   +++    +++      +++    +++
NSE       1:150    +++    ++       ++     ++
Syn       1:60     +++    + ~ ++   ++    ++  
根据以上结果,我们发现DAKO公司出品的EnVison检测系统对膜抗原的表达性最强,但核表达差一点;而Antibody公司出品的Two-Step检测系统和Zymed公司出品的超强型PV6000检测系统非常相似,对核抗原的表达性很强,对膜表达的抗原相对较弱。为了让核抗原和膜抗原能同时得到充分的表达,我们将EnVison与Two-Step按一定比例混合,对染色结果进行比较,发现用DAKO公司出品的EnVison检测系统与Antibody公司出品的Two-Step检测系统或Zymed公司出品的超强型PV6000检测系统按7:3或8:2的比例混合,能得到核、膜、浆均满意的结果。
二、讨论
二步法检测系统由于各生产厂家采用的载体不同,导致了其检测系统对各种抗体的敏感度不同。DAKO公司出品的EnVison检测系统是用高分子的葡萄糖作为载体,将大量的二抗分子和HRP(辣根过氧化物酶)结合成多聚体。由于分子量较大,可以结合更多的二抗和过氧化物酶,所有具有很强的信号放大功能,对膜和浆表达的抗体特别敏感;而Antibody公司出品的Two-Step检测系统和Zymed公司出品的超强型PV6000检测系统是在一条氨基酸骨架上将多个辣根过氧化物酶和抗体的Fab段结合成多聚体,对一抗有很大的亲和性。由于二公司在产品开发时将着重点放在核抗原的表达上,所以对一抗为核表达的抗体尤为敏感。而NICHIREI公司出品的N-Histofine检测系统,从设计原理上与Zymed相似,按理说也应比较敏感,但在实际工作中,效果并不十分理想,具体原因有待于进一步探讨。
我们在日常工作中,为了使抗原得到最佳的表达,应该有选择的应用检测系统。实验证明,DAKO公司出品的EnVison检测系统与Antibody公司出品的Two-Step检测系统或Zymed公司出品的超强型PV6000检测系统按7:3或8:2的比例混合,能得到核、膜、浆均满意的结果,即减少了操作步骤,又增强了抗体的特异性,可提高抗体的稀释比,节约了成本,降低了背景,具有较高的实用价值和经济价值,是各级医院和科研单位值得推荐的方法。





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