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标题: 冰冻切片后都要固定吗？ [打印本页]

作者: lihua328 时间: 2004-3-5 11:23 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

请教：我做脑组织冠状切片，厚30微米
我切后就放到冰箱冻着，准备直接免疫组化，可以吗？急！！！！
谢谢！！！！！！！！

作者: lihua328 时间: 2004-3-5 11:34 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

忘了说了，我取材是用4%的多聚甲醛灌注固定：)

作者: shanghainese 时间: 2004-3-6 00:14 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

引用:

下面引用由lihua328在 2004/03/05 11:23am 发表的内容：
请教：我做脑组织冠状切片，厚30微米
我切后就放到冰箱冻着，准备直接免疫组化，可以吗？急！！！！
谢谢！！！！！！！！

只要切片没有冰结晶，当然可以用。
您的组织冰冻之前已经固定了，切片后不必再固定了。

作者: lihua328 时间: 2004-3-6 17:45 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

谢谢你啦，看来是我自己弄错了别人的意思,呵呵
再问一下抗体稀释一般就是用PBS吧？还有每张玻片大约需要滴多少毫升已稀释的抗体（比如我做的大鼠脑组织冠状切片），谢谢啦！！！

作者: 可乐猫 时间: 2004-3-7 00:41 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

楼上那位，做冰冻切片之前就用醛固定那你还能冻上吗？用什么冷冻方式呢？
我记得过去用半导体冷冻才可以冻前固定。不过那已过时了，现在都现代化了。

作者: lihua328 时间: 2004-3-7 10:03 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

引用:

下面引用由可乐猫在 2004/03/07 00:41am 发表的内容：
楼上那位，做冰冻切片之前就用醛固定那你还能冻上吗？用什么冷冻方式呢？
我记得过去用半导体冷冻才可以冻前固定。不过那已过时了，现在都现代化了。

????
不明白你的意思 :em15:

作者: 可乐猫 时间: 2004-3-7 12:40 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

你的贴子的主题是《冰冻切片都要固定吗？》
难道你问的是石蜡切片？石蜡切片是标本最先固定的。
冰冻切片可是新鲜标本切片后固定。
免疫组化也一样，
但是免疫荧光可千万别固定。

作者: lihua328 时间: 2004-3-7 22:40 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

引用:

下面引用由可乐猫在 2004/03/07 12:40pm 发表的内容：
你的贴子的主题是《冰冻切片都要固定吗？》
难道你问的是石蜡切片？石蜡切片是标本最先固定的。
冰冻切片可是新鲜标本切片后固定。
免疫组化也一样，
...

我是先用多聚甲醛固定再用蔗糖脱水，然后再实行冰冻切片啊
我的意思是是不是切完片后还要用比如丙酮等固定：）

作者: fangdang 时间: 2004-3-8 13:37 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

PBS稀释一抗是可以的,但不能长时间保存.还有每张玻片大约需要滴多少毫升已稀释的抗体?看组织大小而定,一般我是50ul

作者: 可乐猫 时间: 2004-3-8 16:02 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

引用:

下面引用由lihua328在 2004/03/07 10:40pm 发表的内容：
我是先用多聚甲醛固定再用蔗糖脱水，然后再实行冰冻切片啊
我的意思是是不是切完片后还要用比如丙酮等固定：）

不用再固定啦。

作者: lihua328 时间: 2004-3-8 17:59 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

谢谢 fangdang和可乐猫啦：）

有的书上又说要用丙酮4度固定10分钟，不知道有什么不同？
今天我做的时候直接从冰箱拿出来就用pbs洗，结果脱片很厉害，原来之前要风干，呵呵！这风干不知又有什么时间限制没有？请教各位啦！
再次感谢！

作者: 可乐猫 时间: 2004-3-8 19:41 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

在贴片之前还要涂明胶呢，不然也会掉片的。滴加抗体之前必需要风干的。

作者: lihua328 时间: 2004-3-8 20:15 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

但是我的玻片是经过多聚赖氨酸处理过的啊，不用涂明胶了吧

作者: shanghainese 时间: 2004-3-8 23:19 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

引用:

下面引用由lihua328在 2004/03/07 10:40pm 发表的内容：
我是先用多聚甲醛固定再用蔗糖脱水，然后再实行冰冻切片啊
我的意思是是不是切完片后还要用比如丙酮等固定：）

lihua328：
您的组织经过以上处理应该做漂片(floating section),而不是普通的冰冻切片，所以不需要丙酮4度固定和风干等等。切片在组化染色过程中始终是在浸染状态。染后一般不需苏木素套色复染。您可多看一点脑免疫组化文章，大部分用的是这种方法。

作者: lihua328 时间: 2004-3-9 11:54 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

非常谢谢shanghainese！
难怪我也听一位老师说：他采用普通的冰冻切片做了很久都没做出来，后来用漂片法就做出来啦！
是不是我用这种方法一定要用漂片法啊？用普通的冰冻切片能否有可能做出来呢？
今天我试了几片染色效果不理想，我还怀疑是不是我灭活的时候用的是0.5％的H2O2甲醇溶液不行，我还打算再用3％的试试看。
请shanghainese 赐教！！万分感谢！！！

作者: lihua328 时间: 2004-3-9 17:56 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

查了一些文献，发现大家在用漂片法时，好像没有经过加正常山羊血清封闭，是不是不用啊？还有就是用漂片法是不是一抗的稀释程度要大很多啊，好像都是1：1000什么的，这样能不能做出来呢？
谢谢！！！！

作者: shanghainese 时间: 2004-3-9 23:25 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

引用:

下面引用由lihua328在 2004/03/09 11:54am 发表的内容：
非常谢谢shanghainese！
难怪我也听一位老师说：他采用普通的冰冻切片做了很久都没做出来，后来用漂片法就做出来啦！
是不是我用这种方法一定要用漂片法啊？用普通的冰冻切片能否有可能做出来呢？
今天我试了几　...

关于是否一定要用漂片法，要由您自己决定。漂片法是脑神经组织学领域里经典的方法。由于神经细胞体积大，一般冰冻和石蜡切片(5微米)不能观察到细胞的整体。而漂片的厚度在20至40微米，适宜观察神经细胞，这是其一。其次，您要用一般冰冻和石蜡切片法也行，但形态，观感和染色结果都可能与漂片不一样。将来您的文章要发表，审稿关能否通过呢？希望您能考虑这些问题。
至於一抗的浓度，可以参考厂商的说明书。您也可以摸几个不同的浓度。
另外，不是任何抗体都能做免疫组化的。用抗体之前除了多看文献，还要向厂商多了解抗体具体使用情况。

作者: lihua328 时间: 2004-3-13 23:23 标题: 冰冻切片后都要固定吗？

非常感谢 shanghainese 前辈！

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