标题:
急求助!如何降低假阳性?
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作者:
zxx9
时间:
2005-4-7 16:14
标题:
急求助!如何降低假阳性?
我最近购买了新二抗(与以前所用的同一公司)、新的DAB显色组合(以前是自己配制,然后过滤),将1月份切的组织片用同样的方法试染了一次,结果同一组织以前染色阴性的地方都变成阳性了,几乎没有阴性,背景也较高;而阴性对照则正常。请问:
这是不是就叫假阳性,主要问题出在哪个环节,该如何纠正?
作者:
shanghainese
时间:
2005-4-7 23:22
标题:
急求助!如何降低假阳性?
如果您愿意的话,请您做下面的实验并把结果告诉我。
第一张切片,用原来的一抗(一月份用的),原来的二抗,自己配制的DAB。
第二张切片,用原来的一抗(一月份用的),新的二抗,自己配制的DAB。
第三张切片,用原来的一抗(一月份用的),原来的二抗,新的DAB。
第四张切片,用原来的一抗(一月份用的),新的二抗,新的DAB。
第五张切片,PBS,原来的二抗,自己配制的DAB。
第六张切片,PBS,新的二抗,自己配制的DAB。
第七张切片,PBS,原来的二抗,新的DAB。
第八张切片,PBS,新的二抗,新的DAB。
第九张切片,PBS,PBS,自己配制的DAB。
第八张切片,PBS,PBS,新的DAB。
作者:
fangdang
时间:
2005-4-9 22:58
标题:
急求助!如何降低假阳性?
shanghaiese老师设计的试验将会揭露你试验中所存在的所有问题了。
作者:
zxx9
时间:
2005-4-13 18:16
标题:
急求助!如何降低假阳性?
shanghaiese老师:您好!
我按您的设计进行试验,结果如下: (由于我没有这么多一样的组织片,下列切片不是来源于同一蜡块,仅1.2同一来源切片,3.4同一来源切片,5.6同一来源切片,7.8同一来源切片,9.10同一来源切片。)
第一张切片,用原来的一抗(一月份用的),原来的二抗,自己配制的DAB。
阴性、阳性均有
第二张切片,用原来的一抗(一月份用的),新的二抗,自己配制的DAB。
阴性、阳性均有
第三张切片,用原来的一抗(一月份用的),原来的二抗,新的DAB。
几乎全阳性
第四张切片,用原来的一抗(一月份用的),新的二抗,新的DAB。
95%以上阳性
第五张切片,PBS,原来的二抗,自己配制的DAB。
阴性
第六张切片,PBS,新的二抗,自己配制的DAB。
阴性
第七张切片,PBS,原来的二抗,新的DAB。
阴性
第八张切片,PBS,新的二抗,新的DAB。
阴性
第九张切片,PBS,PBS,自己配制的DAB。
阴性
第八张切片,PBS,PBS,新的DAB。
阴性
另外我做了一组用30倍稀释的DAB(其他都是20倍稀释),是去年7月份切的片子,两片不是来源于同一蜡块,其他同第3、第4片,结果为阴性、阳性均有。
根据这个结果是否可以认为问题在于DAB浓度过高。
作者:
shanghainese
时间:
2005-4-13 23:21
标题:
急求助!如何降低假阳性?
怪我没说清楚,没让您彻底明白,请您原谅。我的本意是这所有的片子都应该是同一蜡块的,这样才能比较。
请您用显微镜看一看,第一张切片和第二张切片,第三张切片和第四张切片,它们的染色是否一致。它们的染色强度是否一致。如果一致那么您的二抗和DAB就没问题。
背景高和您的一抗,二抗浓度过高有关,与您的抗体孵育时间过长温度过高有关,如果您的DAB显色超过5分钟也会产生高背景。
作者:
zxx9
时间:
2005-4-14 18:04
标题:
急求助!如何降低假阳性?
shanghaiese老师:您好!
非常感谢您的帮助!
因为我们实验室自已没有切片机,在切片上很不方便,所以只用先前剩下的切片实验。
由于有部分掉片,两片的组织结构均不全,很难一一对比,只好把染色位置分为胞核、胞浆,把DAB显色强度分1-5级,这种情况下,
第一张切片和第二张切片的染色位置一致,染色强度基本一致(不完全一样,但在同一级,2级)。
第三张切片和第四张切片,胞核、胞浆全部显色,所以染色位置一致;染色强度不一致,第三张切片约为5级,第四张切片约为4级。
老师,如果二抗和DAB试剂均没问题,只是DAB浓度的问题,那为什么第四张切片有那么强的非特异性反应,而同第四张切片一样试剂的阴性对照一点非特异性反应都没有。(这次实验所用切片之前均有染过,都正常,阴性、阳性均有)
再次谢谢您,也希望再次得到您的帮助。
作者:
shanghainese
时间:
2005-4-15 02:05
标题:
急求助!如何降低假阳性?
我没有看过您的切片,也不知道您的蜡块组织的质量任何?难判断。但我感觉你的第一,第二张切片与第三,第四张切片的质量相差很大。因为“第三张切片和第四张切片,胞核、胞浆全部显色,所以染色位置一致”而第一,第二张切片没有这样的现象。我认为这才是造成您背景高的主要原因。
“染色强度不一致,第三张切片约为5级,第四张切片约为4级。”是因为它们的二抗有些差异。
您新的二抗问题不大,但我不知您用的浓度是否很好。这一点你可以查查说明书等等。
看来您新的DAB没有您自己配制的好。
您问为什么第四张切片有那么强的非特异性反应,而同第四张切片一样试剂的阴性对照一点非特异性反应都没有?
因为DBA的反应需要HRP(辣根过氧化酶)的作用。而阴性对照是没有HRP(被洗掉了或没加),所以看不出DAB的好坏。
作者:
zxx9
时间:
2005-4-15 10:24
标题:
急求助!如何降低假阳性?
shanghaiese老师,谢谢您!
我用的是皮肤组织,蜡块组织的质量不大好。
我的二抗是“ready to use"的,可能不同批次的差异。
依您看,如果在DAB的浓度上进行试验,是否会让问题更明确。
选6张同一蜡块的切片,
第一张切片,用原来的一抗,新的二抗,新的DAB(1:20)。
第二张切片,用原来的一抗,新的二抗,新的DAB(1:40)。
第三张切片,用原来的一抗,新的二抗,新的DAB(1:80)。
第四张切片,用原来的一抗,新的二抗,新的DAB(1:160)。
第五张切片,用原来的一抗,原来的二抗,自己配制的DAB。
第六张切片,用原来的一抗,新的二抗,自己配制的DAB。
第七张切片,PBS,新的二抗,新的DAB(1:20)。
您看是否有这个必要,或者其他建议。
作者:
shanghainese
时间:
2005-4-15 11:03
标题:
急求助!如何降低假阳性?
您可以也有必要调整试剂包括一抗,二抗,Streptavidin-HRP, DAB的浓度,找到最佳浓度。
但是如果蜡块质量不好,您是无法做出好的结果来的,这不是背景高和试剂不好的问题。
作者:
闲云
时间:
2005-4-26 15:56
标题:
急求助!如何降低假阳性?
如果你的一抗灵敏性很高,我觉得你可以尽量稀释,上千倍都可以,我都用过一种抗体,就是这样的,对结果也没什么影响!
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