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标题: [原创]求助 [打印本页]

作者: iamsnake 时间: 2005-11-9 20:07 标题: [原创]求助

[watermark] 我现在做细胞免疫化学，步骤如下：1．捞出细胞爬片,PBS洗2次,每次3~5分钟
2．%多聚甲醛固定30’,蒸馏水洗5min/次×2次
3．甲油标记
4.  3％H2O2-甲醇灭活内源性过氧化酶15～30min；（现配现用）
5.  PBS洗1～2次或者双蒸水洗3～4次×5min/次；
6.  滴加5%BSA封闭液于37℃，放置湿盒中孵育20～30min后，摔去多余液体，不洗；（用剪碎的滤纸吸干波片上的液体）
7.  滴加一抗（1：150），37℃，30min~2h或者20℃1~2h，也可以4℃过夜（也可37℃孵育1~2h，然后再4℃过夜）
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9.  PBS洗3～5min/次×3次;
10. 滴加生物素化山羊抗兔IgG（二抗），20～37℃，孵育10~15min；
11.  PBS洗3~5min/次×3次;（若背景染色深,可延长洗涤时间2~4倍）
12. 滴加SABC，室温或37℃孵育10~15min；
13.  PBS洗5min/次×3~4次; （若背景染色深,可延长洗涤时间2~4倍）
14. 滴加DAB，室温暗室（避光）显色5～30min，镜下控制反应时间，有表达后蒸馏水洗5min/次×3次以中止反应；（胞浆染黄色）
15. 生物素复染30sec~2min后蒸馏水洗；（细胞核染蓝色）
16. 镜下观察，晒干；
17. 用滤纸擦干(不要破坏标本)，中性树胶封片，晾干高倍镜下观察，阳性计数。*****阴性对照：PBS代替一抗
可是做了几次，都没有结果，根本就没有染上颜色，求教各位大侠，分析分析一下原因，救救小弟。谢谢！[/watermark]

作者: shanghainese 时间: 2005-11-10 00:41 标题: [原创]求助

我做细胞免疫化学情况如下：(仅供参考)
一抗孵育时间是一小时，20℃。或在4℃(冰箱里)过夜。
二抗和SABC是30分钟，20℃
DAB，室温（不需避光），显色时间少于5分钟。
苏木素套染(细胞核--蓝色)。
在做细胞免疫化学时，最好用Triton X-100,或其它的detergent破细胞膜。
您做了几次，都没有结果。我认为您首先看看您使用的一抗能否用于福尔马林固定的细胞上。其次看看在您的实验里所设的阳性对照是否阳性？

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