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标题: 求助CD34组化实验~谢谢 [打印本页]

作者: mooom 时间: 2006-10-10 09:24 标题: 求助CD34组化实验~谢谢

[背景]：
令我崩溃的CD34
俺非病理专业，让我做这组化，从头学习，是外行，我做了快1个月了，还是不大摸门路，有很多问题要请教大牛们~

[内容]：考察裸鼠的癌组织中的血管密度分布情况

[方法]：SABC三步法

[1抗]：Santa Cruz SC-7045
CD34 (C-18) is an affinity purified goat polyclonal antibody raised against a peptide mapping at the C-terminus of CD34 of human origin.
CD34 (C-18) is recommended for detection of CD34 of mouse, rat and human origin by Western Blotting, immunofluorescence (1:50-1:500).
[2抗]：兔子抗山羊生物素化抗体（工作液）
[3抗]： SABC（工作液）

[流程]：
1，肿瘤取出4%多聚甲醛30分钟，4度30%蔗糖过夜，oct包埋
2，冰冻切片后，吹干，丙酮固定30分钟。蒸馏水洗。
3， 30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温浸泡30分钟，灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗
4，加5%BSA封闭液,室温20分钟。甩去多余液体, 不洗。
5，滴加适当稀释的一抗，孵育，PBS（pH7.2-7.6）洗2分钟×3次。
6，滴加2抗，20分钟。PBS（pH7.2-7.6）洗2分钟×3次
7，滴加试剂SABC,20-37℃ 20分钟。PBS（pH7.2-7.6）洗5分钟×4次。
8， DAB显色，镜下控制反应时间大约3-5分钟。
9，苏木素轻度复染

[问题]：
1，阳性片（肝）加一抗从1：50到1：2000，视野都很黄。好象和抗体浓度没什么关系。
2，阳性片（肝）不加一抗，只加2，3抗，也是满世界黄。
3，还改变过孵育温度20度2小时；37度1小时；4度过夜，效果类似。
4，固定方法，新鲜组织直接包埋，切片后丙酮固定30分钟重复操作，结果类似。
5，血管位置没有明显的着色，和背景好像差不多。貌似1抗没有和抗原特异性结合。

看见文献上人家做的好漂亮，医院里面给人做的cd34也狂漂亮，着急啊。老板也着急，我也着急毕业阿。。。。各位大侠看看我还什么地方不对，可能出问题了。不会是一抗有问题吧？
不胜感谢

作者: shanghainese 时间: 2006-10-10 09:44

告诉你吧,
这是肝脏里内源性生物素作的怪.

作者: mooom 时间: 2006-10-10 10:03 标题: 回复 #2 shanghainese 的帖子

我也有考虑过,我定了一个"亲和素"书上说可以封闭?不知道你作过吗?管用否?

作者: 喜力 时间: 2006-10-10 21:30

啥地方的?
来南京我帮你搞定;.....看你做实验累死了....

作者: dingwei 时间: 2006-10-15 09:20

买一个二步法试剂盒（无内源性生物素）试一下吧。

作者: fangdang 时间: 2006-10-24 11:56

楼主，你的实验根本是无法进行的。种植肿瘤中间质血管应该是鼠源性的，你用鼠抗人的CD34去做这样的实验，根本无法作出真正的阳性，和阴性对照。

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