间接免疫荧光法操作流程
滴定平板技术™

（以5×5mm反应区为例） 为了使实验操作标准化，欧蒙开发了滴定平板技术™ : 滴加标本或标记抗体至加样板的反应区，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始。系统的几何结构决定了液滴的位置和高度。因为液体被局限在一封闭的空间里，所以不再需要传统的“湿盒”。并且可在一致的反应条件下同时温育任何数量的标本。 准备：检查加样板是否反应区亲水而周边疏水。如果不是，用湿纸巾擦干净，必要时可用一点家用洗涤剂，再用足量的水冲洗。随后从试剂盒中取出载片，等平衡到室温时方可打开包装。注意不要触及生物薄片。必要时可用笔编号、标记。 稀释：根据实验设计，用磷酸盐缓冲液（PBS-Tween 20）稀释血清。注意：阳性和阴性对照不需稀释，使用前要混匀，每次实验均须做对照。 加样：将加样板放在泡沫板上，按顺序分别滴加25ul稀释后的血清至加样板的反应区中，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育（一次最多200份）。 第一次温育：将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反应立即开始。确保每一个标本均与生物薄片接触，且标本间互不接触。室温温育30分钟。 清洗：用烧杯盛磷酸盐缓冲液流水冲洗载片1秒钟（注意水流不要太急，不要直接对着基质冲），然后立即（不要吹干）将其浸入装有磷酸盐缓冲液的小杯中浸洗至少1分钟。不需振荡。 加样：滴加20ul FITC标记的抗人免疫球蛋白（结合物）至洁净加样板的反应区中，完全加完所有的二抗后，方可继续温育。注意：FITC标记的抗人免疫球蛋白使用前需混匀。为节约时间，可在第一步温育的同时滴加荧光二抗至另一个加样板的反应区中。 第二次温育：从磷酸盐缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。室温温育30分钟。从现在开始，注意避免阳光直射载片。 清洗：用烧杯盛磷酸盐缓冲液流水冲洗载片1秒钟（注意水流不要太急，不要直接对着基质冲），然后立即将其浸入装有磷酸盐缓冲液的小杯中浸洗至少1分钟。可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴伊文氏蓝作为衬染。 封片：将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加甘油/PBS至盖玻片：每一个反应区约10ul。从磷酸盐缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。将载片覆有生物薄片的一面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并轻轻调整使盖玻片嵌入到载片的凹槽里。然后继续下一张。 结果判断：荧光显微镜下观察特异的荧光模型。