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标题: 切片有裂纹及灰染怎么办？ [打印本页]

作者: 淡若水 时间: 2008-7-16 06:34 标题: 切片有裂纹及灰染怎么办？

切片有裂纹及灰染怎么办，我曾经想过很多办法都没有解决好这个问题，下面是我在网上看见的类似我的问题，敬请同行指教：

[attach]1739[/attach]

作者: 淡若水 时间: 2008-7-16 21:07 标题: 切片的裂纹和灰染

最明显的是细胞丰富的宫内膜腺癌和这两张图片的结肠病变。我曾经想过很多办法：对裂纹,我采取过重新冷冻腊块，选用新的刀片，将切片厚度切的更薄，如4’，染色完成后,经过梯度酒精,再进入二甲苯,然后再加盖片,这些措施,可以使切片有点改善,但是还是没法根本解决问题。片子发灰的问题，我试过延长染色时间，和延长分化时间，效果也是收效甚微，殷切希望同道给予指点。

作者: ChenRong 时间: 2008-7-17 20:24

和固定与脱水有关，特别是脱水，最好调下。
你说的在冻和换新刀，当冻的太厉害了，用新刀很容易弄出这个情况来

作者: 淡若水 时间: 2008-7-18 11:49

谢谢版主的指点。

作者: 淡若水 时间: 2008-7-18 20:39

我的脱水透明浸蜡程序大概如下：

1.  80% 酒精       30分钟－6小时，
2.  90％酒精       30分钟－6小时，

（以下是进入自动脱水机）
3.  93％酒精          30分钟
4.  95％酒精          30分钟
5.  95％酒精          30分钟
6.  97％酒精          30分钟
7. 100％酒精          30分钟
8. 100％酒精          30分钟－12小时（有时需要过夜）
9.    二甲苯          30分钟
10. 二甲苯          30分钟
11. 二甲苯          30分钟
12.    石蜡（50－52度） 30分钟  （缸温 70度，以下同）
13.    石蜡（50－52度） 30分钟
14.    石蜡（60－62度） 30分钟

切片机是徕卡的轮转式切片机，刀片是用的徕卡的818.
因为标本量不算太大，大约每年1200例左右，所以试剂一般一周更换一次。一般组织基本还是比较满意，就是宫内膜癌和上面那种细胞丰富的消化道腺癌出现裂纹和片子发灰的情况，问题究竟出在那儿？请版主和其他同道提出宝贵意见

[ 本帖最后由淡若水于 2008-7-18 20:42 编辑 ]

作者: 镜子王朝 时间: 2008-7-18 22:44

嗯。同意版主意见。裂纹主要是冻得太久。而且从脱水时间看，个人觉得高浓度长了点，组织本就有些硬了，再一久冻，就可能裂纹。
发灰，主要是固定问题。另外，可以检查一下苏木素。

[ 本帖最后由镜子王朝于 2008-7-18 22:49 编辑 ]

作者: 淡若水 时间: 2008-7-19 11:34

切片前我的腊块只是放在冷藏室的冷水里，连冰块都没有。应该不存在过冻的问题，只是会不会冷冻不够？
   放入冷水前，我是让蜡块完全凝固了，才放在冷水里的，蜡块一般不会产生裂纹。
   因为怕脱水机过夜遇到打雷、停电或者其他机器故障，所以常常只走到纯酒精一步，就关机，第二天上班再开机，走完后面的程序。这样处理的结果，一般宫内膜和小组织，切片也没有什么异常。只有宫内膜癌和我下载的肠道细胞丰富的病变，才出现这样的情况。
   以后我遇到宫内膜癌的时候，再试一试，纯酒精不放长了，看单独脱水的效果怎样。
   至于片子发灰的问题，用同样的苏木素，其他组织又没有这样的现象。似乎也不好用苏木素解释。下面是一张甲状腺的片子，胞浆也没有这种现象啊。
[attach]1794[/attach]

[ 本帖最后由淡若水于 2008-7-19 12:06 编辑 ]

作者: ChenRong 时间: 2008-7-19 21:40

1.  80% 酒精       1小时，
2.  90％酒精       1小时，

（以下是进入自动脱水机）
3.  93％酒精          1小时
4.  95％酒精          1小时
5.  95％酒精          1小时
6.  97％酒精          1小时
7. 100％酒精          1小时
8. 100％酒精          1.5小时
9.    二甲苯          15分钟
10. 二甲苯          25分钟
11. 二甲苯          30分钟
12.    石蜡（58-60度） 1小时  （缸温 61度）
13.    石蜡（58-60度） 1小时（缸温 61度）
14.    石蜡（58-60度） 1小时 (缸温 61度)
注：
1，你酒精的浓度没给你改，每人的用法不同，但不用精确到97%吧，没那么准。
2，蜡都用58-60的为好，第一道蜡进入了二甲苯很容易硬度下降
3，100%过夜不好，还是不要这样。
4，我给你改的时间是大小标本同脱水的时间，小标本（如胃镜），酒精都改10到20分钟就够了。但很多医院还达不到分开的条件。（同脱时容易过头的小东西用纱布包一包，让它不易脱水）
5，二甲苯如果是加温到35度时间控制在45-60分钟
6，脱水没有绝对的，还是要考自己慢慢摸索，我改的只是参考。

作者: ChenRong 时间: 2008-7-19 21:41

忘了，发灰还是固定的原因多点.

作者: 淡若水 时间: 2008-7-20 06:51

谢谢版主，用心给我回了帖子。如果按照版主的意见，确实解决了我的问题。那倒是解决了我多年来的一个大难题。
酒精97％的浓度，是个大概，是利用纯酒精浓度不够后的再利用。前面的95％的酒精，我是用的工业酒精，这样成本可以降低。（会不会影响免疫组化，我不知道，但是似乎对HE片子没有影响）如果这一缸的浓度低于了95％，我就废弃不用了。因为杂志上有文章介绍，高浓度的酒精里溶有较多脂肪，如果浓度降低后，继续前移使用，会影响制片效果。

作者: 淡若水 时间: 2008-7-20 11:25

我用的上海的

作者: 淡若水 时间: 2008-7-23 20:59

版主给我建议的脱水程序，我试了一下，蜡块确实有改进,过去胶质丰富的甲状腺病变，按我的方案做出来的组织块。又硬又脆，如果不经过特殊处理，而是按普通方法切片的话，滤泡中的胶质完全成粉末状。现在软多了，皮肤组织也好切多了。谢谢了。
在回答其它朋友的问题时，我查了下笔记，《诊断病理学杂志》07年P474,《关于组织切片裂隙的处理》一文，也是针对切片有裂隙的问题的，看来这个问题还有一定的普遍性。文中用5mmol/L的盐酸溶液处理蜡块，我试过，用它处理变硬脆的甲状腺，效果还不错。文章说的是淋巴结等富于细胞的组织。看来我的宫内膜腺癌也应该属于这种情况了，我再试一试。

作者: Azwangwei 时间: 2008-7-31 14:41

1.你的脱水方式的确有与众不同之处，可能是你过于谨慎、小心。没有充分利用脱水机给技术工作带来的便捷，不必为偶发事件（如你所说的雷电、停电、机械故障），而进行非常对待。这样很累、也很不方便。
2. 现代病理技术的发展非常迅速，病理技术正从手工作坊式的模式朝着机械化、自动化、标准化的方向发展，应充分利用现代病理设备给技术工作带来效率和便捷。应该说目前的病理产品在质量上还是有保障的，你例举的雷电、停电、机械故障在各单位各地都会出现，但大多数不会以“停机”的方式来处理。
3.以上几位认为你的组织固定有问题，以及组织在酒精的时间稍长（考虑酒精对组织的硬化作用）。也有同感，在使用脱水机进行脱水时，一般在第一缸都设置固定液，而后是酒精梯度等等。主要是对取材组织块进行再固定，以弥补大标本固定不透。另外、从你科的工作量（1200例/年）显示并不算多，但试剂更换可能过于平凡，你可尝试将试剂定期更换改为定量更换，但要考虑当地的气候因素的影响。

作者: 淡若水 时间: 2008-7-31 18:21

谢谢楼上的意见。能不能提供一下你的脱水、透明和浸蜡的程序，很想看看你的程序是怎么设置的，我会仔细考虑你的意见的。
过去我对标本的固定这一步，没有足够的重视，现在我注意到了这个问题。

不过，今天中午，我们这儿打雷，可能是停了一会儿电，程序显示屏变成了空白，机器停止了运行。幸好脱水机没有被打坏，但是脱水机里我设的几种程序，全变成了相同的一种。我赶快重新设过，才走完了全程，没有耽误包埋切片。
还好不是过夜，如果标本停在了二甲苯里，那标本就废了。
我最怕的是，放入脱水机的标本是唯一的小块组织，一旦出了问题，连补救的机会都没有了。

当然我用的是国产的脱水机，5.7万，也不是好高级的，可能进口的高级脱水机没有这样的顾虑吧？

至于更换酒精，我是用酒精比重计测试过，再更换的。尽管我的标本不是太多，但是除非标本实在太少，一般一周后，最后一缸的酒精最多就只有98％的浓度了，要保证脱水彻底，就只有将浓度降低了的酒精移往前一缸了。

[ 本帖最后由淡若水于 2008-8-6 20:04 编辑 ]

作者: 淡若水 时间: 2008-8-1 06:00

卫生部的《临床技术操作规范?病理学分册》中关于脱水透明浸蜡的意见是这样的：

㈦常用固定液
...
2．乙醇－甲醛（酒精－福尔马林，AF）固定液
甲醛（40%） 100ml
95%乙醇 900ml
［说明］一般组织块经乙醇－甲醛固定1～2小时后，即可移入95%乙醇内脱水。
...
二、常规石蜡包埋组织切片（常规切片）的制备
....
㈢常规切片的手工操作（步骤次序和各步骤的持续时间）
1．水洗：用流水冲洗已经固定的组织块30min。
2．脱水（常温下）
（1）乙醇－甲醛（AF）液固定    60~120min
（2）80%乙醇          60~120min
（3）95%乙醇Ⅰ       60~120min
（4）95%乙醇Ⅱ          60~120min
（5）无水乙醇Ⅰ       60~120min
（6）无水乙醇Ⅱ       60~120min
（7）无水乙醇Ⅲ          60min
［注意事项］①未经充分固定的组织不得进入脱水程序。②用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5～10倍以上。③自低浓度乙醇向高浓度乙醇逐级移进脱水。 ④脱水试剂应及时过滤、更换（500ml乙醇可用于500个组织块脱水；加入硫酸铜的无水乙醇变蓝时，提示需要更换）。⑤较大组织块的脱水时间长于较小者，应将两者分开进行脱水。⑥组织置于无水乙醇内的时间不宜过长（以免硬化）。⑦丙酮脱水性能强，会使组织块过缩、硬脆，不宜用以替代无水乙醇。
3．透明
（1）二甲苯Ⅰ                20min
（2）二甲苯Ⅱ                         20min
（3）二甲苯Ⅲ                         20min
［注意事项］①二甲苯的容积应为组织块总体积的5～10倍以上。②组织块在二甲苯中透明的时间不宜过长（以防组织硬、脆），并依不同种类组织及其大小而异；组织呈现棕黄或暗红色透明即可。③二甲苯应及时过滤、更换。④组织经二甲苯适度处理后不显透明时，常提示该组织的固定或脱水不充分，应查找原因并妥善处理。
4．浸蜡
（1）石蜡Ⅰ（45~50℃）    60min
（2）石蜡Ⅱ（56~58℃）    60min
（3）石蜡Ⅲ（56~58℃）             60min
［注意事项］①熔化石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中（70
℃）进行，不得用明火加温。②熔蜡的容积应为组织块总体积的5～10倍以上。③组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程，应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带入熔蜡中。④浸蜡时间适宜，过短时浸蜡不充分（组织过软），过长时组织硬脆。⑤熔蜡应及时过滤、更换。

以上是卫生部的技术操作规范上的。

我的固定液是用的普通的10％福尔马林，没有采用中性福尔马林的配方。
低浓度的酒精我是采用的高浓度的酒精，工作一段时间浓度降低后的。纯酒精则从第六缸只用到第4缸，就废弃不再用了。一来是为了节约酒精，二来也是觉得用高浓度的酒精加水配制低浓度的酒精麻烦。而且随着每天标本的处理，每天的酒精浓度都在变化。随便那种浓度的设置都只是理论上的浓度。
不知道这样的处理有什么不妥当没有？

[ 本帖最后由淡若水于 2008-8-2 07:02 编辑 ]

作者: Azwangwei 时间: 2008-8-6 08:20

组织处理系统工作程序1（用于日常脱水）
溶液种类时间加温搅拌真空负压
1 AF固定液 60分钟
2 80%酒精溶液脱水 60分钟
3 95%酒精溶液I脱水 60分钟
4 95%酒精溶液I脱水 60分钟
5 95%酒精溶液II脱水 60分钟
6 纯酒精溶液I脱水 60分钟
7 纯酒精溶液II脱水 60分钟
8 纯酒精溶液III脱水 60分钟
9 二甲苯溶液I透明 30分钟
10 二甲苯溶液II透明 60分钟
I 48~50℃石蜡浸蜡 60分钟
II 50~56℃石蜡浸蜡 60分钟
III 58~60℃石蜡浸蜡 60分钟
IV 58~60℃石蜡浸蜡 60分钟
当日下午5：30开始~次日上午7：30结束

（脱水机为日本樱花，300块）

作者: 淡若水 时间: 2008-8-6 20:46

感谢17楼与我们分享自己的脱水程序。下班组织进入脱水机，次日上班即可包埋，确实是充分的发挥了机器的潜力。
不过让人感兴趣的是：
1.你们的包埋机，多久开机？上班就可以开始包埋么？如果还得等半个小时蜡融化了，才能包埋。看来组织块在蜡里的时间即使稍微长点，也对切片影响不大了。
2.这款机器，遇到雷击、停电，怎么避免组织块停在二甲苯或蜡里的时间太长？
我的机器是常州中威的，说明书上虽然有保护措施，遇到停电，脱水蓝可以自动退回到纯酒精内，但是因为商家没有配电源，实际上我的机器没有这项保护功能。
3.你的脱水机各缸的试剂，怎样保持其应该有的浓度？自动更换试剂么？试剂的耗费量大不大？
4.机器值多少钱？
5.这款机器的故障率高不高？
知道一些病理科常用机器性能的提升，还是让人感觉耳目一新的。

作者: lijie208239 时间: 2008-8-6 21:15

不错、

作者: Azwangwei 时间: 2008-8-7 09:16

1．包埋机长期处于待机状态（7天长假时关机）每天7：20—9：00处于工作状态，上班就可以进行包埋。脱水机基本上是长期处于待机状态，节假日走特定脱水程序。
2．你说的雷电情况（你咨询相关专家，雷击仅仅是脱水机出现故障，还是你院其他设备也出现故障），我们从未遇见过，至于停电一般都是短暂的，脱水机会自动记录停电时间，待来电后继续完成在该缸设置的工作时间（不能扣除停电的时间）。
3．脱水机不能避免因停电等原因组织在二甲苯、石蜡的停留时间过长的问题，因为脱水机都是来自发达国家的，工业基础较高，停电的机遇很少。
4．不用刻意保持其试剂的浓度，我们每周更换一次，只更换固定液、第一缸脱水液、第一缸二甲苯，可通过脱水机自动更换。
5．任何设备都会有故障，有关机器价格你最好咨询相关厂家或代理商。现代病理技术发展很快，有关内容你可登录华夏病理网-常规技术一览，我科有系列有关病理技术室方面的内容介绍。

作者: 淡若水 时间: 2008-8-7 12:55

羡慕你们的条件。
我一定会去华夏病理网的常规技术一览，拜读你科的系列有关病理技术室方面的内容介绍的。
不过，所有的电器似乎都怕雷击哦。我们这儿可是雷区，几乎每年夏天都有人死于雷击的。我们附近一家医院的的B超机就发生过被雷击坏了的事件。在我们医院，如果遇到雷阵雨，彩超机，B超机，都要关机，甚至连电源都要断开的。

作者: ChenRong 时间: 2008-8-7 14:23

你们是哪啊，如果在手术中不会把呼吸机也关了的吧。

作者: Azwangwei 时间: 2008-8-7 19:36

这样看来，你那的工作不仅艰辛，而且还有一定的危险，要注意安全哦。

作者: 淡若水 时间: 2008-8-7 22:28

人倒没有危险。
但是我们这儿确实怕贵重设备被雷打坏。
前几天的雷阵雨，工作中的我的脱水机的程序都不见了，机器不走了。不清楚是雷击的直接影响或是因为雷击停电的间接影响。现在动不动病人就要找医院扯皮，标本出了问题，麻烦就来了。我这儿只有这个条件，干到这一行，辛苦点吧，还是尽量不惹麻烦为好。

[ 本帖最后由淡若水于 2008-8-7 22:53 编辑 ]

作者: jdk1986 时间: 2008-8-24 22:23

呵呵。我这有点不同。
1.固定液4小时。
2.70的酒精1.5小时。
3.80的酒精1.5小时。
4.95的酒精1.5小时。
5.95的酒精1.5小时。
6.无水酒精1.5小时。
7.无水酒精1.5小时。
8.松节油1.5小时。
9.松节油1.5小时。
10.蜡1小时。
11.蜡1小时。
12.蜡1小时。

作者: 淡若水 时间: 2008-8-25 12:19

如果片子质量不错，有兴趣的是：
1.你们的固定液是用的什么？
2.如果是用的脱水机，那你们固定后也没有水洗这一步了？
3.松节油透明，好处是不用二甲苯了。松节油的消耗量和二甲苯比，那个大些？试剂的更换更勤或是更耐用？
望赐教。

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