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标题: 求教！冰冻免疫组化！ [打印本页]

作者: junyi4444 时间: 2008-12-3 19:34 标题: 求教！冰冻免疫组化！

我想用新鲜冰冻组织做免疫组化，方法如下：

术中冰冻的新鲜组织，在恒温冰冻机中零下18—20度冰冻10分钟左右，切片4微米，（明胶片和普通片各捞一张），然后进入4度的丙酮固定20分钟，水洗，进蒸馏水，再进3%双氧水消除内源过氧化物酶15分钟。进PBS振洗，再用血清37度封闭10分钟。然后再加一抗，二抗等等，按常规的免疫组化来做。

我的方法对吗？冰冻的温度.时间应该是多少呢？组织切多厚好些呢？内源过氧化物酶是不是用双氧水甲醇效果更好些呢？

到最后总是掉片，胶片的稍微好一些。是不是因为中间用PBS振洗的次数多了呢？

这是怎么回事呢？

作者: junyi4444 时间: 2008-12-3 19:40

是不是冰冻组织得先在-40°——-70°中冷冻30——60分钟，再恒温切片呢？

作者: junyi4444 时间: 2008-12-3 19:57

网上找到一篇

实验所使用冷冻切片机型号为MLCROM HM505E,固定液的配制参照文献[1]并做适当改进:95%乙醇49.5ml与乙醚49.5ml两者混合后加入冰醋酸1ml。1.2方法①5μm厚冷冻切片裱与普通清洁的载玻片上(无需防脱片处理);②固定液中固定1min;③流水冲洗30s,蒸馏水洗30s;④内源性生物素的封闭:⑤滴加一抗37℃温箱湿盒中作用30min,PBS洗1min×3次;⑥滴加二抗37℃温箱湿盒中作用15min,PBS洗1min×3次;⑦滴加DNB显色1min,水洗30s;⑧苏木**复染15s、分化、水洗,促蓝液中10s,脱水封片

作者: junyi4444 时间: 2008-12-4 20:29

老师们，。教教我吧，。急呀。

网上也找不到类似的

作者: shanghainese 时间: 2008-12-5 00:36

Frozen Sections 冰冻切片
   Snap frozen fresh tissues in liquid nitrogen or isopentane pre-cooled in liquid nitrogen, embedded in OCT compound in cryomolds. Store frozen blocks at - 80 ºC.  新鲜组织包埋在装有OTC的冰冻包埋盒里，放入液氮或液氮预冷的异戊烷中速冻。冰冻快储存在-8 0º冻箱里。
   Cut 4-8 um thick cryostat sections and mount on superfrost plus slides or gelatin coated slides. Store slides at - 80 ºC until needed. 冰冻切片 4-8 微米，贴在superfrost plus 或涂有明胶的（防脱）载玻片上。片子储存在-8 0º冻箱里直到用时。
   Before staining, warm slides at room temperature for 30 minutes and fix in ice cold acetone for 5 minutes. Air dry for 30 minutes.  染色之前，切片在室温复温30分钟，冷丙酮固定5分钟。然后再空气干燥30分钟。
   Wash in PBS 磷酸缓冲液洗。

作者: shanghainese 时间: 2008-12-5 00:44

染色
进3 ~ 0.3%双氧水消除内源过氧化物酶15分钟。PBS洗，再用血清37度封闭10 ~ 30分钟（可省）。然后再加一抗，二抗等等，按常规的免疫组化来做。

作者: shanghainese 时间: 2008-12-5 00:45

PBS冲洗，浸洗就可以了。

作者: junyi4444 时间: 2008-12-5 18:59

shanghainese老师

我们科没有液氮和-8 0º冻箱，能做吗？只有莱卡的恒温冰冻切片机。
我是把送来的术中冰冻组织直接取材，（不包埋，不放入液氮或液氮预冷的异戊烷中速冻）然后放在恒温冰冻切片机中，-20度冷冻，大概10分钟，硬了以后就切片5微米片子，（也不储存在-8 0º冻箱，）稍干后直接冷丙酮固定，这样可以吗？

术中冰冻切片 4-8 微米，也就相当与HE的2-4微米吧，我切5微米是不是有点太薄了呢？

作者: junyi4444 时间: 2008-12-5 22:00 标题: 冰冻切片机

我科冰冻切片机

作者: shanghainese 时间: 2008-12-5 23:52

引用:

原帖由 junyi4444 于 2008-12-5 18:59 发表
shanghainese老师

我们科没有液氮和-8 0º冻箱，能做吗？只有莱卡的恒温冰冻切片机。
我是把送来的术中冰冻组织直接取材，（不包埋，不放入液氮或液氮预冷的异戊烷中速冻）然后放在恒温冰冻切片机中 ...

可以这样做，但是容易产生冰结晶。
切5微米一点不薄。

作者: 永远 时间: 2008-12-8 10:53

我的一位老师曾教了我这样一套方法，他也是在书上查的：
新鲜组织取材，冰冻切片机切片4-8微米，放置室温（72小时内），做之前丙酮固定20min，放入干燥箱内干燥15分钟（干燥箱设为室温约25°C），后面同常规步骤；
冰冻切片保存：用干燥纸盒存放，并用胶带封好，放置于4度冰箱，可保存数月。

作者: junyi4444 时间: 2008-12-8 20:46

谢谢。我的片子做出来结构模糊不清，根本不能看。可能是我切完片子干的不透吧。明天我找你的方法试试看吧。

谢谢大家

作者: meizhou 时间: 2008-12-14 23:22

个人觉得你可以拿个泡沫盒，买点液氮，取组织冻结后再将组织放回-20，然后切片

作者: meizhou 时间: 2008-12-14 23:23

模糊不清可能就是冰晶的原因，切片玻璃化，样品冻结效果差

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