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标题: 从自信到自以为是，我犯的一个错误 [打印本页]

作者: dingwei 时间: 2008-12-31 22:03 标题: 从自信到自以为是，我犯的一个错误

2007年，一个偶然的机会，我发现有家医院的免疫组化结果：Ki-67，P53，ER、PR等阳性细胞数有点少，大概只有30-40%，如果是一二例，结果应该没问题，然而一年以来都是这样，而CK、EMA、CD20、CD79a、CD45，CD45ORO等浆与膜表达的标记很好，感觉告诉我那里出问题了。他的操作过程是：
1、脱蜡至水
2、甲醇双氧水阻断。
3、蒸馏水洗
4、用电磁炉最大档或中档加热，因处理片子不多，在高压锅里放上蒸馏水，里面放一500ml烧杯，烧杯里放300ml 柠檬酸ph6. 0抗原修复液，把片子放在烧杯里。加热戴帽出气后3分钟，关闭电磁炉。
5、自来水冲高压锅快速冷却，打开高压锅盖，用冷水慢慢冲入高压锅内至冷。
6、蒸馏水洗
7、缓冲液洗三道
8、加一抗（37℃孵育60分钟）
9、蒸馏水洗，缓冲液洗三道
10、加EnVision检测系统（37℃孵育30分钟）
11、蒸馏水洗，缓冲液洗三道
12、DAB显色。
问题出在那呢？那只有一条一条去排除。
一、碰到这样的情况我本应该首先考虑是不是一抗出问题了，但他们用了一年，一抗换了几次了，所以我想是不是组织处理导致其些抗原丢失了。所以，让他切了几张片子，我拿回自己科室做了一下，发现阳性率在80-90%左右，也就是说组织是没有问题的。
二、要考虑一抗是不是有问题，如果是原液，应该考虑稀释比对不对，如果是即用型，应该考虑有效期、厂家有没有配正确、运输过程中有没有出现意外等。用其的一抗与我们的检测系统配合，实验结果阳性很好，一抗没有问题。
三、考虑检测系统有没有问题，不同的检测系统，敏感度不同，相对应的一抗浓度也不相同，要考虑检测系统与一抗浓度是否相配，同时也要考虑质量有没有问题。用其的检测系统与我们的一抗相配，与他自己的一抗相配，实验结果阳性也很好，检测系统没有问题。
四、抗原修复有没有问题？抗原修复液是否有效？pH值是否正确？高压锅有没有问题？结果都没有问题。
五、缓冲液是否有问题？是否因为蒸馏水pH值不对？结果都没问题。
六、DAB有没有问题？结果没有。
七、技术员操作有问题？我亲自到他们科室去做，结果和他做的一样，回到我科室又好了。
能想的问题都想到了，那还有什么我们没有想到的呢？
唯一区别的只有加热工具了，我们用电炉加热，他们用电磁炉，从理论上说，不管什么样的加热工具，只要能达到温度，高压锅出气戴帽后，里面的温度是恒定的。抗原修复应该与温度与时间相关。抱着试一下的心态用让他用电炉试了一下，没想到问题解决了。
是电磁炉的原因，我很兴奋，终于解决了，是什么原因呢？我特意买了只电磁炉，从400W开始到2100W，每一档都用了二十几个抗体做了实验，并与电炉作比较：发现凡膜与浆的抗体基本没有差异，而核抗原随着电磁炉的功率的增加，阳性细胞数减少，阳性强度降低。我重复了十几次，结果都是一致的，问另一个用电磁炉修复的医院，方法也和前面医院的相同，结果也一样，换了电炉后问题也就解决了。
我相信自己已经找到问题的所在，是电磁炉的原故，那什么原因呢？为什么只出现在抗里呢？我上网查了一下，发现有十几万篇有关电磁波对DNA损伤的论文，是不是电磁波破坏了DNA，从而损伤了抗体的活性呢？如果是这样，那就解释得通为什么功率越大，阳性细胞越少。于是，我写了篇文章，有关电磁炉对抗免疫组化的影响，但有些大医院的技术员说他们也用电磁炉，没有发现这种现象。我充分相信自己的结论，因为这是一年以来用电磁炉后存在的现象，自己做了十几遍重复性在100%。总认为他们肯定没有做过与电炉的对照，而且，电磁炉对核抗原的影响只是细胞的减少，并不是完全没有，具有欺骗性，他们没有发现而以。一年来，我总是相信自己的结论，对别人的意见不予理睬，因为没有人告诉我他们做过对照。
然而，多次与梁英杰老师交流，他说他们曾做过实验，电磁炉与微波炉比较，电磁炉比微波炉强，想起一年来别人的不同意见，这让我对我的实验产生了怀疑。中华病理杂志的霍临明老师告诉我实验要严谨，让我彻底冷静下来。那问题到底出在那呢？
经过一天二夜的冥思苦想，我终于想到了自己实验出现这种结果的原因，是一个从来都认为不可能有区别的地方。通过反复实验，证明这种想法是正确的。为了科学的严谨,我立即给SCI收录的美国Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology杂志写信，撤回了已经三次修回待发表的文章。
什么原因，我现在不想说，希望你们也能想一想，这对你们以后解决问题有好处。
我想说的是，为什么一年多来，面对别人的不同意见我会如此自以为是，总认为自己是对的，如果早一点重视，一个错误的观点也不会坚持了一年多。这是过于自信了，这就象很多的技术员总觉得自己做的不错，自己做的就是正确的，对别人的意见听不进，特别是有大医院的和有点年纪的，就象我。
虚心使人进步，骄傲使人落后，重视别人不同意见，接受别人的看法，才能使自己少走弯路，才能使自己不断进步，这需要勇气和智慧。
我把这句话作为新年祝词，与朋友们共勉。

作者: ChenRong 时间: 2009-1-1 10:12

会不会是电磁炉抵挡和高档的时间上面的问题？

作者: 秕谷 时间: 2009-1-1 10:16 标题: 急切想知道答案

作者: 秕谷 时间: 2009-1-1 10:32

丁老师，您好！我是温岭中医院的，昨天还碰到您父亲了，和他聊了几句。在新的一年里，祝您和您的家人新年快乐！万事如意！昨天我们的一个在你们那进修的同事带回来在嘉兴开会的资料，上面有您的一篇文章，我和主任还讨论了一番，今天一早就又看到您这篇文章了。可以说，我们也是用电磁炉的，方法几乎和上面您说的那家医院一样，当然我们碰到的问题也一样，现在感觉您已经找到答案了，急切的想知道，私下告诉我也行，我的QQ是104349015，技术群里有我的，本来我是沙发的，刚出了点意外估计就板凳了，新的一年板凳也是不错的，就是有点凉

作者: 秕谷 时间: 2009-1-1 10:54

难道是高压锅里再用烧杯的原因？实在想不出还有什么不同了

作者: ChenRong 时间: 2009-1-1 14:12

引用:

原帖由秕谷于 2009-1-1 10:54 发表
难道是高压锅里再用烧杯的原因？实在想不出还有什么不同了

丁老弄的是3人沙发，大家一起坐，暖和点。
多个烧杯有这个可能，就像做炖蛋时加个碗，可以均匀的受热，里面的洞洞少点。原理差不多。
等待佳音。。。

作者: dingwei 时间: 2009-1-1 14:58

就是高压锅里再用烧杯的原因，由于电磁炉加热太快，烧杯内的温度与高压锅内的液体温度不能同步，导致必须使用高温修复的抗原修复时间不够，功率越大，加热速度越快，抗原暴露也越差，而用电炉加热较慢，有足够的时间让杯里的水温升高，也就没有这种情况。所以电磁炉抗原修复应该直接将缓冲液放入高压锅内，而且结果与功率无关。一种巧合，正好这些需要高温修复的抗原大多是核抗原，让我误认为电磁波对核抗原有影响，而国外对电磁波对人的影响很重视，电磁波的确对活体的DNA损伤很严重，而且我的实验结果又很稳定，所以我一直坚持自己的错误观点，哈哈。今天终于搞清楚了。

作者: ChenRong 时间: 2009-1-1 20:26

有错就要罚，就给我们一人寄个电磁炉吧，好暖暖

作者: 秕谷 时间: 2009-1-1 21:08

那还有个问题想和大家探讨一样,就是怎么样才能用电磁炉做出好片子呢?照这个原因是不是改用低档或是不用烧杯直接放锅里呢?直接放锅里我感觉容易掉片,掉片可是一件很让人烦的事,那我看以后就用低挡慢慢加热看看,真所谓慢工出细活,看来我们搞免疫组化的人急不得啊,不知道大家有什么好办法呢???

作者: dingwei 时间: 2009-1-1 21:41

组织处理好不会掉片，我们一直都是直接放锅里。

作者: 黄树叶 时间: 2009-1-2 13:00

我在实习的时候帮组化的老师做了ER PR CerbB-2 HPV 和P53 可是我做了一年也没发现P53有阳性的并且在同批做时ER PR CerbB-2 HPV都各有阳性就是P53没有出现过阳性（P53）是做乳腺癌的我们直接放电磁炉内修复一直到现在我都不知道什么原因希望丁老师给指点一下？

作者: 黄树叶 时间: 2009-1-2 13:03

补充一下抗体都是同一批买的会不会抗体P53失效呢？可惜我现在不在那个医院了现在没机会寻找到真谛了

作者: dingwei 时间: 2009-1-4 17:54

抗体P53失效的可能性最大

作者: zlixin 时间: 2009-1-4 20:00

版主的那篇文章我拜读过，是送到我们主任那里审稿时拜读的，那时就想向版主提出疑问，其实这就是我们所说的直接热修复和间接热修复。如果采用间接热修复需要延长修复时间，周小鸽教授他们做过相关实验，我记忆好像是需要修复15分钟以上，记不大清了，但通过我们日常工作还是觉得高压直接热修复是最好的，至于是采用什么加热好像没本质差别，主要是修复时间要够，但不能过长。

作者: dingwei 时间: 2009-1-4 20:39

是的，我以前一直认为抗原高温修复主要是高压出气后的三分钟，我做过测试，高压出气后1分钟，拿去帽子，测了一下里面烧杯的温度，和锅内的是一致的，所以说，从升温到戴帽这段时间也很重要，保证高压下一致温度3分钟也但重要，只有保证一定的时间后，抗原才能暴露，具体差异在那？时间要多长？我也说不清。用电炉，直接与间接结果是一样的，也没有查到有人说二者是有差异的；用电磁炉，最低功率时，直接与间接结果也差不多。以后注意一下直接与间接相同总共需要多少时间。
具体问题的关键是不是在烧杯中的温度不能保证在3分钟内保持120度，我不是很清楚。要想搞清楚只要再做一下高功率下出气4分钟、5分钟可能就有结论了。

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