标题: 冷冻切片间接免疫荧光组织 实验步骤 讨论 [打印本页]
作者: Nic 时间: 2009-5-18 14:48 标题: 冷冻切片间接免疫荧光组织 实验步骤 讨论
冷冻切片间接免疫荧光组织 实验步骤 讨论大家好，帮我看看这个 大鼠膀胱组织 冷冻切片的 间接免疫荧光 实验步骤有哪些问题~~~
实验步骤
- 将冰冻切片入4°丙酮内固定10分钟
晾干 - 用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗切片3X3min，再用0.1％Tritonx－100处理15min
- PBS漂洗切片，使切片保持一定湿度。
- 0.03%双氧水/甲醇 封闭内源性过氧化物酶20 min(25℃)
- 1% BSA室温孵育30min 后加入C-kit 单抗4℃过夜。
- 加C-kit 荧光标记2抗，以下步骤需避光操作。25℃,孵育60min。
PBS漂洗3X5min
取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。- 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度
大家帮我看看 这个实验步骤有些什么问题。。谢谢大家。。
我有2个问题：
1.大鼠膀胱组织是用丙醇固定 好还是用 多聚甲醛呢 ？
2.我想问7--8步骤之间如果 加个 0.01%伊文氏蓝衬染1-3min, 跟现在相比哪个好，该不该加？
作者: shanghainese 时间: 2009-5-18 21:53
C-kit/CD117不需要用Tritonx－100处理。
丙酮固定的切片也不需要用Tritonx－100处理。
衬染要根据不同的荧光染料而定。
选用何种固定剂要根据一抗的要求而选择。
作者: Nic 时间: 2009-5-19 18:09
哦 。谢谢啊
今天去医院学习冷冻切片了的。。
他们那是快速切片 苏木素染色的，
我要是自己切冷冻切片 的做免疫荧光 。 切到载玻片上以后该如何处理。
如何保存？
谢谢
作者: shanghainese 时间: 2009-5-19 22:16
研究生要多看点书。
作者: Nic 时间: 2009-5-20 15:59
- -
书上我看是说什么 用载玻片贴片，丙酮固定，准备染色。。
其实我是想问问实际方面的操作。。有人回答一下 我更放心。。。。。
如果切片完 丙酮固定 完。 现在用不到的，放-80 冰箱对否？
作者: Nic 时间: 2009-5-20 16:02
还有就是。我的2个二抗 荧光标记 分别为 FITC 和 罗丹明。。
这个组合需要衬染否
再次谢谢。。。。
作者: shanghainese 时间: 2009-5-27 14:16
根据需要而定。
作者: colin 时间: 2009-6-23 17:13
引用:
原帖由 Nic 于 2009-5-20 16:02 发表 
还有就是。我的2个二抗 荧光标记 分别为 FITC 和 罗丹明。。
这个组合需要衬染否
再次谢谢。。。。
有时候直接法做出来背景有点深,一般情况也没有做过衬染.其实觉得背景问题应该是洗片和载玻片本身不干净.所以一般控制一下,这个问题都解决了,荧光标记感觉比组化好控制.
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