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标题: 关于免疫组化问题、请高手及老师指点迷津、谢谢 [打印本页]

作者: xm0610105 时间: 2009-10-30 09:38 标题: 关于免疫组化问题、请高手及老师指点迷津、谢谢

小妹做免疫组化已经有一段时间了、条件一直摸不准、现在最棘手的问题是：
1、苏木精复染后整张片子的核不是蓝色、而是发红、有人跟我讲可能是苏木精的配置问题或是苏木精过期所致、但是我师姐之前是用一样的苏木精做的免疫组化、没有问题的、核染得很得当，到我这里怎么不行了呢、还有人跟我讲是DAB显色过度导致、我不明白这是什么概念，我显色了6分钟、算是过度了吗？补充一下我用的是武汉博士德的免疫组化试剂盒。
2、再有、我做阴性对照、总是会有阳性着色的地方、是内源性酶和生物素没处理好吗？我灭活了20分钟、封闭了20分钟
3、我拜读过很多人的贴子、有的说免疫组化苏木精复染后不要分化、有的说需要分化、那到底要不要分化？我迷惑了、、、我的核本来就染不上色、分化了是不是更染不上了？
4、为了让各位高手及老师更清楚的找到我的问题出现在哪里、下面我附上我的实验步骤、请详读，谢谢：
  （1）切片（切片机)、展片（40度左右）、烘片(37度24小时以上但不超过28小时）
  （2）脱蜡至水（二甲苯15min、二甲苯15min、二甲苯：乙醇=1：1  5min 、100%酒精5分钟、95%酒精、90%酒精、80%、70%、60%、50%、30%酒精中各5分钟、蒸馏水中30分钟）
（3）3%H2O2灭活内源性酶20分钟、蒸馏水洗3次
（4）热抗原修复（构橼酸缓冲液反复两次、后自然冷却至室温）PBS洗2min*3次
（5）滴加5%BSA封闭液室温20分钟  倒掉其余液体不洗
（6）添加一抗 1：100    37 度45分钟 PBS洗2min*3次同时做对照、用PBS替代一抗
（7）滴加二抗  室温20分钟 PBS洗2min*3次
（8）滴加SABC 室温20分钟 PBS洗5min*4次
（9） DAB显色6分钟、现配现用、蒸馏水洗
（10）苏木精复染2分钟、蒸馏水洗净、
（11）盐酸酒精分化3~5秒  自来水洗净、浸在自来水中5分钟
（12）梯度酒精（70%、80%、95%、100%）各3分钟脱水，二甲苯：酒精=1：1，纯二甲苯、纯二甲苯各15min透明，中性树胶封片、镜检
请各位高手及老师指点迷津、小妹不胜感激。

作者: shanghainese 时间: 2009-10-31 12:02

苏木精复染后整张片子的核不是蓝色、而是发红的问题。
建议您在第十一步（11）盐酸酒精分化3~5秒自来水洗20~30分钟。

作者: shanghainese 时间: 2009-10-31 12:05

阴性对照、总是会有阳性着色的问题比较复杂，也不了解您是如何设定阴性对照的。
建议您用Isotype Control 作为阴性对照。

作者: xm0610105 时间: 2009-11-2 08:48 标题: 回复 3# 的帖子

我是用PBS替代一抗做的对照。。至于阴性上面的着色是某个地方着色、并不是全片着色、您能帮着分析下市什么原因吗？谢谢

作者: xm0610105 时间: 2009-11-2 08:48

好的、

作者: shanghainese 时间: 2009-11-2 12:39

用PBS替代一抗做的对照意义不大。

作者: xm0610105 时间: 2009-11-2 15:06 标题: 回复 6# 的帖子

关于“PBS替代一抗做对照意义不大”您能不能讲的具体一点、、还有您说的Isotype Control 我不懂是什么东西、、我免疫组化这块还是菜鸟级别、、我是本科生做毕业论文所用，谢谢您不吝指教！

作者: shanghainese 时间: 2009-11-3 13:02

引用:

原帖由 xm0610105 于 2009-11-2 15:06 发表
关于“PBS替代一抗做对照意义不大”您能不能讲的具体一点、、还有您说的Isotype Control 我不懂是什么东西、、我免疫组化这块还是菜鸟级别、、我是本科生做毕业论文所用，谢谢您不吝指教！

http://bbs.dingw.com/thread-2086-1-1.html

作者: xm0610105 时间: 2009-11-4 10:57 标题: 回复 8# 的帖子

原来如此、、谢谢您嘞！

作者: xm0610105 时间: 2009-11-8 15:40 标题: 回复 2# 的帖子

shanghainese老师、我想给您发张我做免疫组化的照片、让您帮忙看看我的问题出在哪里了、可是我不知道怎么发、您能否给个您的邮箱、我直接发到您邮箱去、谢谢您嘞、

作者: 黑色的天空 时间: 2010-3-23 21:54

有的真是菜鸟啊
建议你先抗原微波修复，这样先把封闭的抗原暴漏出来，再自然冷却
自然冷却后，用蒸馏水洗（本人都用自来水先洗，再蒸馏水），再放到双氧水里阻断
还有一抗时间到了后，建议你自来水充分水洗，在放到PBS液中缓冲
注意这些，你的片子绝对背景清晰，胞核清楚，没有假阳性

作者: 吴尚汉 时间: 2010-4-12 15:07

01066931807电话我吧！

作者: juefei 时间: 2010-7-20 06:45 标题: l

自然冷却一般多长时间？

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