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标题: 关于免疫组化问题、请高手及老师指点迷津、谢谢 [打印本页]

作者: xm0610105    时间: 2009-10-30 09:38     标题: 关于免疫组化问题、请高手及老师指点迷津、谢谢

小妹做免疫组化已经有一段时间了、条件一直摸不准、现在最棘手的问题是:
1、苏木精复染后整张片子的核不是蓝色、而是发红、有人跟我讲可能是苏木精的配置问题或是苏木精过期所致、但是我师姐之前是用一样的苏木精做的免疫组化、没有问题的、核染得很得当,到我这里怎么不行了呢、还有人跟我讲是DAB显色过度导致、我不明白这是什么概念,我显色了6分钟、算是过度了吗?补充一下我用的是武汉博士德的免疫组化试剂盒。
2、再有、我做阴性对照、总是会有阳性着色的地方、是内源性酶和生物素没处理好吗?我灭活了20分钟、封闭了20分钟
3、我拜读过很多人的贴子、有的说免疫组化苏木精复染后不要分化、有的说需要分化、那到底要不要分化?我迷惑了、、、我的核本来就染不上色、分化了是不是更染不上了?
4、为了让各位高手及老师更清楚的找到我的问题出现在哪里、下面我附上我的实验步骤、请详读,谢谢:
  (1)切片(切片机)、展片(40度左右)、烘片(37度24小时以上但不超过28小时)
  (2)脱蜡至水(二甲苯15min、二甲苯15min、二甲苯:乙醇=1:1  5min   、100%酒精5分钟、95%酒精、90%酒精、80%、70%、60%、50%、30%酒精中各5分钟、蒸馏水中30分钟)
   (3)3%H2O2灭活内源性酶20分钟、蒸馏水洗3次
   (4)热抗原修复 (构橼酸缓冲液 反复两次 、后自然冷却至室温)PBS洗2min*3次
   (5)滴加5%BSA封闭液 室温20分钟  倒掉其余液体 不洗
   (6)添加一抗 1:100     37 度45分钟   PBS洗2min*3次   同时做对照、用PBS替代一抗
   (7)滴加二抗  室温20分钟    PBS洗2min*3次
   (8)滴加SABC   室温20分钟   PBS洗5min*4次
   (9) DAB显色6分钟、现配现用 、蒸馏水洗
   (10)苏木精复染2分钟、蒸馏水洗净、
   (11)盐酸酒精分化3~5秒  自来水洗净、浸在自来水中5分钟
    (12)梯度酒精(70%、80%、95%、100%)各3分钟脱水,二甲苯:酒精=1:1,纯二甲苯、纯二甲苯各15min透明,中性树胶封片、镜检
    请各位高手及老师指点迷津、小妹不胜感激。
作者: shanghainese    时间: 2009-10-31 12:02

苏木精复染后整张片子的核不是蓝色、而是发红的问题。
建议您在第十一步(11)盐酸酒精分化3~5秒  自来水洗20~30分钟。
作者: shanghainese    时间: 2009-10-31 12:05

阴性对照、总是会有阳性着色的问题比较复杂,也不了解您是如何设定阴性对照的。
建议您用Isotype Control 作为阴性对照。
作者: xm0610105    时间: 2009-11-2 08:48     标题: 回复 3# 的帖子

我是用PBS替代一抗做的对照。。至于阴性上面的着色是某个地方着色、并不是全片着色、您能帮着分析下市什么原因吗?谢谢
作者: xm0610105    时间: 2009-11-2 08:48

好的、
作者: shanghainese    时间: 2009-11-2 12:39

用PBS替代一抗做的对照意义不大。
作者: xm0610105    时间: 2009-11-2 15:06     标题: 回复 6# 的帖子

关于“PBS替代一抗做对照意义不大”您能不能讲的具体一点、、还有您说的Isotype Control 我不懂是什么东西、、我免疫组化这块还是菜鸟级别、、我是本科生做毕业论文所用,谢谢您不吝指教!
作者: shanghainese    时间: 2009-11-3 13:02

引用:
原帖由 xm0610105 于 2009-11-2 15:06 发表
关于“PBS替代一抗做对照意义不大”您能不能讲的具体一点、、还有您说的Isotype Control 我不懂是什么东西、、我免疫组化这块还是菜鸟级别、、我是本科生做毕业论文所用,谢谢您不吝指教!
http://bbs.dingw.com/thread-2086-1-1.html
作者: xm0610105    时间: 2009-11-4 10:57     标题: 回复 8# 的帖子

原来如此、、谢谢您嘞!
作者: xm0610105    时间: 2009-11-8 15:40     标题: 回复 2# 的帖子

shanghainese老师、我想给您发张我做免疫组化的照片、让您帮忙看看我的问题出在哪里了、可是我不知道怎么发、您能否给个您的邮箱、我直接发到您邮箱去、谢谢您嘞、
作者: 黑色的天空    时间: 2010-3-23 21:54

有的真是菜鸟啊
建议你先抗原微波修复,这样先把封闭的抗原暴漏出来,再自然冷却
自然冷却后,用蒸馏水洗(本人都用自来水先洗,再蒸馏水),再放到双氧水里阻断
还有一抗时间到了后,建议你自来水充分水洗,在放到PBS液中缓冲
注意这些,你的片子绝对背景清晰,胞核清楚,没有假阳性
作者: 吴尚汉    时间: 2010-4-12 15:07

01066931807电话我吧!
作者: juefei    时间: 2010-7-20 06:45     标题: l

自然冷却一般多长时间?




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