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双重免疫组化的步骤?

双重免疫组化的步骤?

请问各位同仁双重免疫组化的步骤和关键点,以及注意事项有哪些?
多谢!

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双重免疫组化的步骤?

1、切片脱蜡至水
2、阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30% H2O2)室
   温20分钟。
3、pH7.2缓冲液洗三次。
4、胰蛋白酶消化37 ℃,30分钟。(或按说明书要求:放入抗原修复液内微波修复20分钟、或电炉加热30分钟、或高压锅加帽出气后3分钟,快速冷却;或不处理)
6、滴加正常血清37 ℃,30分钟。(可不用)
7、擦去多余血清,加一抗37 ℃,30分钟。
8、pH7.2缓冲液洗三次。
9、滴加生物素化二抗,37 ℃,30分钟。
10、pH7.2缓冲液洗三次。
11、滴加ABC或S-P复合物,37 ℃,45分钟。
12、pH7.2缓冲液洗三次。
13、DAB或(BCIP/NBT紫蓝色)显色3~10分钟。
14、pH7.2缓冲液洗三次。
15、双标阻断液,10分钟(可不用)
16、滴加正常血清37 ℃,30分钟。(可不用)
17、擦去多余血清,加第二种一抗37 ℃,30分钟。
18、pH7.2缓冲液洗三次。
19、滴加生物素化二抗,37 ℃,30分钟。
20、滴加碱性磷酸酶复合物,37 ℃,30分钟。
21、AEC显色
22、水洗
23、苏木素淡染,蓝化,脱水,透明,封固。

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