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被烦扰很久的一个问题,求各位同行及老师提点

被烦扰很久的一个问题,求各位同行及老师提点

   每次做出来的免疫组化片子都会有一个共同的问题,就是片子上总是局灶性或者完全性覆盖着一层灰蒙蒙的东西,不知道是什么,早期怀疑是脱蜡不完全,但是现在片子的脱蜡时间都是每缸二甲苯10分钟。。。。又怀疑过是否是滴抗体过程中组织过干燥,但是现在组织带水分湿润操作还是这样的结果,很想知道这种灰蒙蒙的物体到底是个啥,求各位老师能指导下~谢谢,问题片子如下图,MPO尤为明显的分界线,而CD38以及CD79a则呈完全性模糊不清





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应该不是脱蜡不干净,也不是滴抗体过程中组织过干燥,你说说你操作步骤!
(本观点纯属本人意见!仅供参考!)

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回复 2# 的帖子

常规切片——烤片2小时——三缸二甲苯浓度递增脱蜡——三缸酒精浓度递减脱二甲苯——热水洗片5分钟(水温约70度)——冷水洗片5分钟——转入PBS磷酸缓冲液中洗片三次,第一次洗片5分钟,后两次洗片约3分钟——TBS工作液(ph约为6.2)高压修复2分钟——自然冷却后(一般都放在高压锅隔夜)滴加3%过氧化氢封闭内源温箱孵育(30度)10分钟——先用流水冲洗3分钟,后PBS液洗片2次,每次3分钟——开始按指标滴加一抗,温箱孵育(30度)一小时——PBS液洗片三次,每次三分钟——滴加二抗检测,温箱孵育30分钟——PBS液洗片3次,每次三分钟——DBS显色液显色约10分钟——流水冲洗2分钟——苏木素复染约40秒——温水反蓝——95%酒精,无水酒精脱水——二甲苯透明——封片

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1、热水洗片5分钟(水温约70度),最好不用。
2、用TBS工作液(ph约为6.2)高压修复2分钟是错误的,应该用Ph6.0的柠檬酸缓冲液修复。
本人观点纯属个人偏见,希望大家独立判断,正确引用!

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引用:
原帖由 5833001 于 2011-7-26 00:19 发表
常规切片——烤片2小时——三缸二甲苯浓度递增脱蜡——三缸酒精浓度递减脱二甲苯——热水洗片5分钟(水温约70度)——冷水洗片5分钟——转入PBS磷酸缓冲液中洗片三次,第一次洗片5分钟,后两次洗片约3分钟——TBS工作 ...
1、烤片两小时(建议58-60°)不知道你是多少°烤片;
2、热水洗片5分钟建议不用;
3、修复液要看抗体的修复需要,Tris缓冲液(TBS)很少用,一般都用柠檬酸缓冲液;
4、3%过氧化氢一般室温即可(其余也如此);
5、3%过氧化氢后一般不需要用流水冲洗,直接PBS洗三次,每次3-5分钟(其余也如此);
6、DAB显色一般在3-5分钟(镜下观察);
7、苏木素可以稍微在长点,但不能与HE一致,苏木素染色后建议还是需要在盐酸酒精分化,在蓝化。
(纯属本人个人意见)
(本观点纯属本人意见!仅供参考!)

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感觉片子拍的也不好,

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问题解决了吗?

模糊的地方阳性信号正常表达,苏木素的颜色也与清晰的地方没有多少差异,估计是脱水透明封片的问题。
有点感觉是脱水透明时,酒精有残留,酒精可能还有水分。
你的酒精用几缸?二甲苯用几缸?多长时间更新一次?

[ 本帖最后由 王华 于 2011-11-22 20:23 编辑 ]

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唯一的答案:苏木素时间太短,尤其在冬天,苏木素时间应延长。

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试试复染后的脱水酒精从75%到无水酒精多加几个缸会不会好些

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