王华

各位，先提几个问题（大家天天都在烤片，是否深入的想过这样的问题呢？）：


1、为什么需要烤片？

2、为什么切片的水分没烤干，染片时组织容易脱片呢？

3、如果自然晾干水分，没有经过烤片，染片时组织还是会脱片呢？

4、为什么烤片的温度低于蜡的熔解温度，组织也容易脱片呢？

5、“烤片”时产生了什么样的变化，导致组织能粘在载玻片上？


要回答以上的问题，我觉得应该在分子的层面理解载玻片的成分，组织的成分以及在烤片的过程中二者之间发生了怎样的“关系”。

    载玻片的主要成分：为二氧化硅晶体，二氧化硅晶体中，硅原子的4个价电子与4个氧原子形成4个共价键，硅原子位于正四面体的中心，4个氧原子位于正四面体的4个顶角上，SiO₂是表示组成的最简式，仅是表示二氧化硅晶体中硅和氧的原子个数之比。二氧化硅是原子晶体。


    组织中的成分：主要是蛋白质，糖类，核酸等极性大分子物质。


    “烤片”时二氧化硅与组织发生的变化：二氧化硅的氧原子在外层，氧原子具有两对核外孤对电子，可以形成两种类型的键合力：1、氢键，氧原子与组织中的极性分子中的氢原子形成极强的偶极—偶极作用力，这种吸引力称为氢键。高温可以加速分子间的相互震动，促使氢键的形成。氢键是组织与玻片粘连的主要的力。2、配位键，氧原子外层孤对电子与组织中具有外层空轨道的阳离子形成配位键。因组织主要由C、H、O、N构成，具有外层 空轨道的金属离子很少，所以配位键不是主要的结合力。


     如果水分没有烤干，因为水分子是极性分子，水分子与组织中的极性分子形成氢键，阻碍组织与载玻片之间形成氢键，引起脱片。


     防脱载玻片的原理就是在载玻片的表面涂一层更加容易与组织中的极性大分子形成氢键的物质（如多聚赖氨酸，侧链基团为氨基，较二氧化硅分子中的氧原子更易形成氢键），使组织与载玻片更加容易粘连，粘连得更加牢固。

基于以上原理，“烤片”有两个作用：
1、使组织与载玻片粘合。
2、加速干燥切片上的水。



原理想通了就知道如何正确烤片了：
1、烤片温度与时间：在蜡的熔解温度烤可以过夜，或65~70℃，保证水分已被烤干为度（15~20分钟）；
2、尽量晾干水分后再烤片。
如果捞片后切片下有很多水分就马上烤片，因为蜡很快熔解，水分会因为表面张力的作用在组织下聚集呈水滴，引起组织细胞结构收缩或散开，破坏组织细胞的正常结构。所以为保持组织的结构不被破坏，应晾干水分后再烤片。如果需要马上烤片，要将水分尽量甩干再烤。


个人观点，仅供参考！

[ 本帖最后由 王华 于 2011-11-5 10:43 编辑 ]

guting2006

嗯，最近也在想这个问题，刚好老师您帮我解惑了，谢谢，但是老师我还想问一问题，马上烤片和晾干后烤片（在烤片充分的情况下）哪个更容易掉片？还是差不多？谢谢

llj19971997

真是学习了。很佩服你，善于思考。在工作中，冰冻切片，不需要烤片就能粘在片上，而且很紧密，有人说比石蜡切片粘的还牢固。为什么呢？它的原理也像你刚才说过的石蜡烤片的原理相同吗？但是冰冻切片中组织和室温的温度差大约是40多度吧。请您再详细解释一下冰冻切片好么？


另外，我上次做免疫组化没有用防脱片，也没有脱，和涂了防脱片的感觉差不多。我觉得是不是和组织的种类有关。我做的是鼠肺的

王华

无论是晾干后烤片还是马上烤片，原理都是使组织与二氧化硅形成“氢键”，使组织与玻片结合。所以在“结合的牢度”上应该没有什么差异的。

但晾干后烤片与马上烤片对保持组织的形态结构方面还是有一点差异的。
请自己做个试验观察一下吧：
选大一些的组织蜡块，在一张防脱载玻片上连续捞两个组织面，切片垂直放置2~5分钟（使上一个切面干燥，下一个切面还残留有较多的水分），放在65~70℃的平面烤台上烤，同时仔细观察组织的细微变化，15分钟烤干之后染HE，在镜下再观察比较两个切面有什么差异。
无论是工作中的事还是生活中的事，都要通过自己的观察、思考、实践才能很好的理解！这是我的观点哦！

[ 本帖最后由 王华 于 2011-11-5 12:39 编辑 ]

王华

要比较石蜡组织切片与冰冻组织切片的不同，先回答几个问题吧：
一块生的猪肉和一块煮熟的猪肉，在性状上有什么差别？
一块新鲜的组织与一块固定脱水后的组织，在性状上有什么差别？
新鲜的组织是软的，具有粘性的；而煮熟的、固定脱水后的组织是硬的，没有粘性的，为什么？
甲醛固定的原理是什么？
未固定的组织与已固定的组织在分子构象上有什么差别？

      固定的目的使细胞内的蛋白质、糖、酶等各种成分沉淀保存下来，防止组织溶解。
      纯甲醛（HCHO）是一种蒸气，完全溶于水形成37%-40%的甲醛溶液，这种水溶液称为“福尔马林”。在水溶液中，甲醛先于水反应形成亚甲基乙二醇，亚甲基乙二醇与蛋白质含有氢原子的侧链反应脱掉一个水分子形成反应性羟甲基侧链（―CH2―OH）使蛋白质成为不溶性化合物而固定。
      固定前，蛋白质、脂类、核酸等大分子的分子构象是弹性可变的，所以组织是软而粘的。
      固定之后，因为甲醛分子与蛋白质分子形成羟甲基侧链交联，使蛋白质的空间三维构象失去可变性，大分子是“立”起来的。
      有机大分子之间的力决定于两个因素：氢键的数量、不同氢键（N氢键或O氢键）的吸引力。
      固定前的新鲜组织如同一个软和的糯米团，放在玻片上是“趴住的”，与玻片二氧化硅亲密接触，形成的氢键多。
      石蜡切片的组织如同一个硬了的糯米团，在玻片上是“立着的”，因为石蜡的阻碍，未烤片的组织是不能黏在玻片上的。经过烤片，大分子依旧是“立着的”，只有外层的原子能与二氧化硅形成氢键，在氢键的数量上要远远少于新鲜组织。

       基于以上理解，可以解释为何冰冻切片能牢固的黏在玻片上了。
      至于为何不用防脱载玻片做免疫组化，组织不掉片，其实是相通的道理。不同的组织的蛋白质成分是不一样的，与玻片形成的氢键数量、氢键的引力强度就会不一样。氢键数量多，引力大的组织就不会掉片，氢键数量少，引力小的组织就会掉片。建议使用防脱载玻片做免疫组化，只是确保不同组织试验的成功率。

        呵呵.......是不是觉得挺复杂的？
        如果要深刻的理解问题，都需要对问题有深层次的思考才行哦！

        个人观点，仅供参考！  请辩证引用！

[ 本帖最后由 王华 于 2011-11-5 12:34 编辑 ]

弦念

我觉得王华老师真了不起，我在想如果当时上学时教化学的老师要是像你一样，我想我的化学一定会学的比现在要好很多！

luo

学习

llj19971997

谢谢你详细的解答，让我受益匪浅，茅塞顿开。你解释的很清楚，很有逻辑。真是佩服，很好奇你都是从哪里学来的这些东西。你的解释让我心服口服。什么时候你要是开班授课，我一定报名。

王华

感谢支持哦！
我的学习方法是：重新学习化学基础理论知识，在实践中使用化学的观点思考，遇到问题再重新看书寻找解决思路！

小杰

学习了。