此文转载于《诊断病理杂志》December 2006,Vol. 13, No. 6
黏液特殊染色与免疫组化双重染色技术
作者：林蓁( 解放军第174 医院病理科, 福建厦门􀀁 360003
1􀀁2 􀀁 方法
1􀀁2􀀁 1􀀁 标本处理与分组􀀁 所有标本均用4%中性甲醛固定,梯度乙醇脱水, 二甲苯透明, 石蜡包埋。每个蜡块切2 张切
片。组织切片厚3~ 5􀀁m, 裱在涂有防脱片剂的( 10% 多聚赖氨酸) 清洁载玻片上。15 例标本共30 张切片, 分2 组, 第1
组做黏液染色( AB􀀂
AS) 与白血病共同抗原( LCA) 双重染色;第2 组做黏液染色( AB􀀂
AS) 与B 细胞抗体( CD20) 双重染色。
1􀀁2􀀁 2􀀁 黏液特殊染色􀀁 切片二甲苯脱蜡至水, 入3%醋酸3 min; ! 1%爱先蓝( pH2􀀁5) 液30 min, 3%醋酸分化3min, 蒸馏水冲洗3 min; ∀ 新鲜配制0􀀁5% 高碘酸氧化液10~ 15 min,蒸馏水洗2# 3 min; ∃无色品红液( Schiff 液) 10~ 20 min, 蒸馏水冲洗2# 3 min。以0􀀁 2%稀醋酸溶液作为洗脱液将切片洗3 # 3 min。
1􀀁2􀀁 3􀀁 免疫组化染色􀀁 采用SP 法。 PBS 缓冲液充分冲洗3 # 3 min, 3%H2O250 􀀁l 室温孵育10 min, PBS 缓冲液冲洗3#3 min; ! 5% ~ 10% 正常山羊血清50 􀀁l 封闭10 min, 倾去勿洗; ∀ 滴加一抗50 􀀁l; ∃37 % 孵育1~ 3 h, PBS 缓冲液3 #3 min; & 滴加生物素化二抗工作液50 􀀁l, 室温孵育10 min,PBS 缓冲液3 # 3 min; ∋滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液50 􀀁l, 室温孵育10 min, PBS 缓冲液3 # 3 min; ( DAB 显色液100 􀀁l, 显微镜下观察显色效果, PBS 缓冲液3 # 3 min; )蒸馏水冲洗2# 3 min, 将组织切片苏木精染色30 s, 蒸馏水洗2 #3 min, 无水乙醇脱水, 中性树胶封固。以上试剂、抗体均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
2 􀀁 结果
15 例中12 例LCA( + ) 、3 例LCA( ∗ ) , 13 例CD20( + ) 、2 例CD20( ∗ ) 。组织切片经染色后腺体分泌的中性物质呈
鲜红色, 腺体分泌的酸性物质呈天蓝色, 中性和酸性黏液的混合物呈紫红色; 细胞核染色呈深蓝色。免疫组化染色LCA
和CD20( + ) 者胞膜呈棕褐色( 图1~ 4) 。
3􀀁 讨论
双重染色法在操作过程中要根据单项染色的条件, 决定2 种染色步骤的前后顺序[1] 。前种染色方法的染色过程所
使用的试剂及操作, 不得影响到后种染色方法中将要表达物质的化学结构及化学成分, 使其发生变化或变性; 后种染色
方法对前种染色的生成物不得有分解或对其显示颜色有所遮盖。黏液特殊染色与免疫组化双重染色中的技术要点是:
将着色较深、着色面较大、较易着色的黏液特殊染色法放在第1 步骤; 将染色过程较复杂、着色较难的免疫组化染色法放在第2 步骤; 使两种染色的显色得到良好的显示且不互相遮盖。黏液特殊染色中高碘酸液配制必须新鲜, 但要注意高碘酸具有较强氧化性, 浓度过高或染色时间过长, 都将减弱免疫组化染色中组织细胞抗原物质的阳性表达。黏液特殊
染色中改变了组织切片的pH 值, 必须在做免疫组化染色前用PBS 缓冲液充分冲洗调整至pH7􀀁4~ 7􀀁8。我们使用0􀀁2%稀醋酸做洗脱液, 洗去剩余的显色剂及额外生成的复合物,
避免交叉反应, 同时0􀀁2% 稀醋酸不会对组织细胞抗原有所损害。活检标本显示弥漫的淋巴浆细胞浸润伴有淋巴上皮病变时高度提示黏膜相关淋巴瘤[2] 。由于胃肠镜下钳取活检标本体积小、量少、较浅表, 组织经过反复切片有诊断意义的部位容易被切去, 分别单项染色步骤烦琐。我们在同一张组织切片中做黏液特殊染色与免疫组化双重染色, 避免了反复切片, 缩短了时间, 双重染色后生成物显示在组织细胞的不同部位, 各种染色显示的颜色不相互遮盖、不相互干扰, 且色彩鲜艳, 对比明显, 定位清晰, 染色效果佳, 结果令人满意。特别在胃肠黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的诊断中, 能及时为临床提供准确的病理诊断及病理分型, 患者治疗方案也就不必都选择手术。
