改良乙酰胆碱酯酶染色法显示兔骨骼肌运动终板（转载杂志）
运动终板,又称“神经- 肌肉接头”,是支配骨骼肌运动的神经末稍装置,是躯体效应器的典型结构。由脊髓前角或脑干的运动神经元胞体发出的长轴突,在抵达骨骼肌时失去髓鞘, 反复分支, 每一分支形成葡萄状终末, 与骨骼肌纤维建立突触连接。胆碱酯酶是一类糖蛋白,以多种同功酶形式存在于体内。一般可分为真性胆碱酯酶和假性胆碱脂酶。真性胆碱酯酶也称乙酰胆碱酯酶,主要存在于胆碱能神经末梢突触间隙,特别是运动神经终板突触后膜的皱摺中聚集较多,神经肌肉接头处兴奋的传递是通过乙酰胆碱的释放来完成的。胆碱酯酶,属于特异性酯酶, 也是神经系统中的羧基酯酶, 常见于肌肉和胰腺等组织中,本实验应用Karnovsky2Roots乙酰胆碱酯酶染色的改良方法[ 1, 2 ]显示运动终板的形态。
1 材料与方法
1. 1 实验动物 实验用健康成年新西兰兔,体重210～215kg,雌雄不限,共8只,由江苏省农业科学院畜牧兽医研究所提供。
1. 2 取材 兔耳缘静脉推注3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉,取俯卧位。在Medtronic公司KEYPO INT4型肌电图/诱发电位仪引导下,于小腿三头肌处确定运动终板的位置并用美蓝标记,空气栓塞处死动物,取材。
1. 3 试剂配制 Karnovsky2Roots孵育液的配制方法:碘化乙酰硫代胆碱1215 mg; 011 mol/L 磷酸二氢钠7 ml; 011mol/L磷酸氢二钠9 ml; 011 mol/L柠檬酸钠1 ml; 30 mmol/L硫酸酮215 ml; 5 mmol/L铁氰化钾215 ml;蒸馏水2 ml。
1. 4 染色方法 组织置于10%福尔马林溶液中固定1 h,PBS冲洗2次,每次3 min。OCT包埋, 6 μm厚度冰冻连续切片。自然晾干后,放于4 ℃的Karnovsky2Roots孵育液中孵育20 h。孵育完毕,双蒸馏水冲洗,晾干,中性树胶封固。
2 结果
光镜下运动终板呈棕红色,椭圆形(图1、2) 。
3 讨论
本法采用冰冻连续切片染色的方法,使运动终板保持较原始的结构特点,此法具有运动终板显示良好、背景浅染等特点,而且敏感性高、持久保存、成本低廉,是一种简便易行且可靠的染色方法。
胆碱酯酶的化学反应主要是碘化乙酰硫代胆碱释放出硫代胆碱和乙酸。硫代胆碱中的巯基把铁氰化钾还原为亚铁氰化钾,再与硫酸铜离子结合形成不溶性的亚铁氰化铜尚未标准化。EDTA (pH 910)修复液因其碱性较强,易造成切片脱落,且其保质期不长。目前认为,抗原抗体结合的最适pH值为714左右[ 3 ] ,而生理盐水pH值及渗透压与机体内环境最接近[ 4 ] ,因此,在这一点上生理盐水更适宜于用作修复介质,并且很少会出现掉片现象。有人曾用蒸馏水作修复介质并用微波炉加热进行抗原修复[ 5 ] ,该方法对于某些抗原性强的抗体如CK、EMA、desmin、vimentin、HMB45、CD45RO、CD45RB、CD45 (LCA)等效果尚可。但对于那些抗原性较弱的抗体, 特别是某些核抗体如ER、PgR、HPV、NM23、PCNA、p53等则表达欠佳,出现假阴性的几率明显增大。此外,高温高压的反应条件更接近蛋白质的变性、复性反应条件[ 6 ] ,因而高温高压修复可以将假阴性的几率降低到最小限度。我们的结果显示利用生理盐水作为抗原修复液,采用高温高压处理，对于表达弱的抗原亦获得满意结果,而且经我室反复对照验证无明显假阳性与假阴性反应,现已广泛应用于日常免疫组化实验中。笔者认为生理盐水有望作为常规抗原修复介质,利用生理盐水进行抗原修复具有操作简单,用材简便、经济,无需特殊仪器设备等优点,尤其适用
于条件较差的基层医疗单位推广应用。
作者：林 莉,杨 枫,李 霄,李 冰
《临床与实验病理学杂志》2009年
