染色原理二
二、 网状纤维染色 ㈠网状纤维染色的形态特点和染色原理 网状纤维是网状结缔组织内的一种纤维。它由网状细胞可产生，网状细胞是星状多突的细胞，核大，着色较浅，核仁明显，胞质较丰实，胞突彼此连接形成细胞网架。网状纤维细而有分支，穿行于细胞体和突之间，共同构成网状支架。这种纤维用H·Ｅ染色一般不易辨认。若用银氨溶液浸染能使纤维变成黑色，故又称嗜银纤维。
网状纤维的应用比较广泛，用来判定病变组织支架的破坏情况，组织、脏器网状支架的存在与塌陷、完整与破坏、网状纤维的分布及走行，有多少、粗细、疏密或有无断裂形态变化。
网状纤维染色的原理 网状纤维的染色方法很多，但是染色原理基本相同，有以下方面。 （1）氧化 氧化的作用是使网状纤维具有选择性，不经氧化的切片，网状纤维均不能较好地显示出来，常用的氧化剂是高锰酸钾。 （2）漂白 一般采用2%草酸，使漂白后无色。
（3）媒染 作媒染时多用2%硫酸铁氨（俗称铁明矾）。这些试剂可增加网状纤维对银氨液的选择性。 （4）浸银 也称镀银，且不同的银氨液浸染切片，使银氨配位化合物与网状纤维结合，即带正电荷的二氨合银Ag（NHs）+2被具有嗜银性物质的网状纤维吸附，时间从数称钟到数分钟。 （5）还原 甲醛液是还原剂，能把与网状纤维结合的银氨配位化合物网状纤维还原成棕黑色的金属银。
㈡ 网状纤维染色的应用
⑴ 用于显示和鉴别肿瘤的性质和来源 1）显示和区分癌与肉瘤 来源于上皮组织的恶性肿瘤（癌）仅癌巢周围有网状纤维包绕，巢内癌细胞之间则没有网状纤维分部。来源于间叶组织的恶性肿瘤（肉瘤），瘤细胞之间往往可见较多的网状纤存在。
2）显示和区分血管内皮瘤与血管外皮瘤 恶性血管内皮瘤的瘤细胞主要在嗜银纤维鞘结构以内，单个细胞则嗜银纤维包绕；恶性血管内皮瘤的瘤细胞均位于小血管之间网状纤维鞘之外，并有丰富的网状纤维自小血管壁向外呈放射状包绕癌细胞。
3）用以鉴别淋巴细胞肉瘤与网状细胞肉瘤等 在淋巴细胞肉瘤中产生的网状纤维比在正常淋巴结内的网状纤维鞘为减少，网状纤维在瘤细胞间自由行走；而网状细胞肉瘤的网状细胞中会产生较多的网状纤维，与网状细胞紧密粘连，分布于每个细胞之间。
⑵ 用于某些肿瘤的诊断 根据染色所显示的网状纤维多少、分布及行走特点，可用于诊断下列肿瘤。
1）平滑肌肉 细胞之间见有大量平行分布的网状纤维。 2）纤维肉瘤 可见大量网状纤维存在，并且密集包绕细胞。 3）滑膜肉瘤 其梭形细胞也产生网状纤维，但不如纤维肉瘤多。
⑶ 用于观察和研究癌组织的发生、发展及其恶性程度 癌组织发生，发展过程以及癌组织生长速度，可通过网染进行观察和研究，如癌巢周围的网状纤维包囊完整，说明癌组织生长较慢，恶性程度低；再如子宫颈鳞状细胞癌巢周围网状纤维分解，说明癌组织正在扩散，其恶性程度较高。
⑷ 显示与观察基底膜的变化 上皮样间叶细胞、间皮或滑膜等，可形成细胞巢也可产生少量网状纤维，压迫周围网状纤维，但为断断续续的绝不连成一线，不形成基底膜。显示与观察基底膜的存在与否，不但能更有效地判断其上皮来源，而且有助于区分不同来源的上皮肿瘤。如甲状腺髓样癌系假滤泡，无基底膜；滤泡癌或正常滤泡有基底膜。
⑸ 用于坏死组织的结构及类型 1） 凝固性坏死 用ＨＥ染色往往为一片红色的无定形物质，识别不出网状纤维支架的形态。用显示网状纤维的特殊染色方法，可观察到早期凝固性坏死处的网状纤维支架还保留其特点。
2） 肺结核干酪样坏死 结核用网状纤维染色后，可以弄清其病变的起源与发展，并可区分 结核球的类型，即 肺炎型、肉芽肿型、阻塞空洞型。肺炎型的坏死组织中尚存在肺泡状排列的网状纤维；肉芽肿型为大量杂乱排列的网状纤维；阻塞空洞型的内容物则看不到网状纤维。
⑹ 用于显示和研究肝组织病变 用网状纤维的染色法，观察肝脏病变处的网状支架形态、 分布特点及其破坏情况，可以判定和研究其病变性质、程度及其发展与转规。
㈢ 网状纤维染色的注意事项 （1）用新蒸馏水配制最好用双蒸水配制。 （2）所用玻璃器材及载玻片均要达到化学洁净程度，必要时用粘合剂粘连切片，防止脱片现象。 （3）对乙配制好的硝酸银液和氨银溶液，要贮存冰箱中保存待用。
（4）在染色过程中，用染氨银染液或硝酸银液的前后应用蒸馏水洗浸。 （5）氯化金调色和硫代硫酸钠固定的时间不应太长，否则会引起网状纤维染色变淡。 （6）根据诊断需要，可进行胞核染色和其其他套色纤维增染，使色彩更为艳丽、清晰。 （7）切片脱水后及时封片，不宜在空气中停留时间过长，以免产生色素颗粒。
【 氨银液的配制】 取10%硝酸银水溶液5ml于三角烧瓶内，一滴一滴地滴加氨水（氢氧化铵），并同时摇动容器，硝酸银遇到氨水立即产生沉淀，当其沉淀物被溶解时（不能完全溶解也可），再加入3%氢氧化钠水溶液5ml。溶液重新产生沉淀，此时再滴加氨水。至其沉淀被溶解后，（为避免氨水加入过量最好能有少许沉淀物为妥，以免脱片）最后加蒸馏水稀释至50ml 。滤过，贮存于棕色瓶中存放入冰箱备用。临用前取出恢复室温再用。
【染色步骤】 （1） 切片脱蜡至水洗。 （2） 10%高锰酸钾液氧化5’。 （3） 自来水洗。 （4） 2%革酸液漂白1—2’，水洗2’。 （5） 2%硫酸铁铵媒染（铁明矾）1--5’。 （6） 水洗，蒸馏水洗2次。 （7） 滴染氨银液1’左右。
（8） 蒸馏水洗2次。 （9） 10%中性早醛还原30″—1′。 （10） 蒸馏水洗1—2次。 （11） 5%硫代硫酸钠固定5′。 （12） 自来水冲洗，蒸馏水洗。 （13） 复染（对比染色）伊红、中性红、ＶＧ。 （14） 脱水、透明、封片。
【染色结果】 网状纤维染灰黑色，胶元纤维红色，基质黄色。
三、糖原染色
㈠ 糖原的概念 糖原（glycogen）系由糖衍化而来，是单纯的多糖，正常情况下，糖原存在胞浆内，在肝脏、心肌、骨骼、肌肉含量最多，其次如脐带等都有。通常根据机体能量代谢将组成内的糖原分为不稳定性和稳定性两类。不稳定性糖原正常情况下储积于肝脏和肌肉，这种糖原当身体需要能量时很容易转化为葡萄糖。稳定性糖原仅以微量存积于身体的各种组织和细胞中，如神经C、上皮C、软骨细胞、以及白细胞等。
糖原易溶于水，在酶的作用下很容易分解葡萄糖更易溶于水，机体死后1小时葡萄糖可萌明为蔗糖，因此组织必须起新鲜时固定或冰冻起来，固定之前决不能用水或生理盐水浸洗。作为糖原染色的切片，必需经特殊固定液固定后而进行石蜡切片，才能把糖元保存下来。
㈡ 组织固定 1）为了不使糖原损失，一般用含酒精的溶液，如AAF液，无水乙醇80ml，冰醋酸5ml、甲醛10ml。 2）采用低温固定，肝组织放入冰箱，使酶分解糖原慢。进行冰冻切片，可以显示糖原在细胞质内的糖元分布
㈢ 组织固定中的注意事项 1．尽可能选取小块新鲜组织及时固定。 2．多次更换乙醇固定液，在4℃左右温度内固定与保存，是针对糖的性质和避免糖元溶于水而采取的相应措施。 3．乙醇能沉淀白蛋白、球蛋白，亦能核蛋白和糖原，但仍可溶于水。所以最好不单独使用乙醇固定，以乙醇为溶剂的混合固定液固定为佳。
㈣ 糖原染色的应用
1．证明与鉴别细胞内空泡状变性 用ＨＥ染色中，如胞桨内出现大小不等的空泡，可能是脂肪变性，经脂溶性溶剂的脱水透明过程所溶解而形成的空泡；也可能是糖元在经水溶液固定过程中的脱失所致；也可能是单纯的水泡变性，甚至多种空泡变同时存在而不易区别。为了鉴别其性质和含量，则需用糖原染色。
2．心肌病变及其他心血管疾病的诊断 用此法显示可以观察到由缺血缺氧所致急性早期心肌坏死或梗死灶内的糖原明显减少，甚至消失，呈均质的浓染状态；而病灶周围则出现反应性异常糖原增多。
3．糖原累积病诊断和研究 用显示糖原的特染可方法可观察到由先天性遗传缺陷引起的糖原累积病，在肝脏、肾赃、心肌、骨骼肌及网状内皮系统等可有大量的糖原堆积，有时神经细胞也可因糖原沉积而明显肿胀。
4．糖尿病的诊断和研究 在糖尿病时许多赃器有糖原颗粒沉着，肝细胞质内出现大量糖原（也可见于胞核内，称为核糖尿），可使细胞膨大。在肾赃，肾曲小管上皮也可出现糖原，以及心肌纤维内均可见糖原颗粒沉着。
5．用于某些肿瘤的诊断 如肝细胞癌与胆管癌，在染色中肝细胞癌为糖原颗粒呈阳性反应；胆管癌其反应为阴性结果等。
㈤ 糖原染色方法 PAS法——对碘酸雪夫化反应。 它的应用较广泛除用于糖元的鉴定和粘液的显示外，还可以观察肾子球茎底膜，阿米已滋养体和茶霉菌的着色。
【雪夫氏试剂的配制】 ① 碱性品红 1g ② 1 N盐酸 20ml ③ 偏重亚硫酸钠 1g ④ 活性炭 2g ⑤ 蒸馏水 200ml
【配法】 用三角烧并盛蒸馏水200ml煮沸后，加入碱性品红1g，并不断摇动，使碱性品红彻底溶解（溶解液为深红色）。冷却到50℃时，加入1N盐酸20ml，再待冷却至35℃时加入 1g偏重亚硫酸钠，盖紧胶木塞，轻轻摇动使其溶解，此时，碱性品红明显变化，然后使入暗处或冰箱内24h，溶液为淡黄或淡红色，再用活性炭过滤使溶液呈无色——无色品红，又称schiff氏液。贮存于棕色瓶中存放入冰箱备用。
1N盐酸配制，浓盐酸（比重1.19含量22%）8.5ml+蒸水91.5ml。
【染色方法】 （1）组织切片，脱腊至水洗。 （2）蒸馏水洗。 （3）1%过碘酸氧化5--10’。 （4）充分蒸馏水洗。 （5）schiff氏液染色20’（放入暗处）。 （6）自来水洗10’。 （7）脱水、透明、封片
【结果】 糖元为红色颗粒。
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