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染色中的基本原则

六、染色中的基本原则
一、染色前的处理 ㈠ 脱蜡至水  凡是石蜡切片必须经过二甲苯脱蜡，各级乙醇至水洗的过程。（切片脱蜡、二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5’—10’ →95%乙醇ⅠⅡ各5’ →75%乙醇 5’ →自来洗水冲）二甲苯和各级乙醇必须保持一定纯度，不能混入其他杂质成分，而使染色受到影响。
  ㈡  除去汞盐沉淀物   对于用升汞固定或含有升汞混合固定液的切片，切片脱腊后需脱汞（浸入5%碘酒精10’），脱碘（5%硫代硫酸钠）→流水洗→染色。
㈢  脱甲醛色素   甲醛固定组织时间较长及温度较高情况下，甲醛易氧化自行分解产生甲酸，导致组织成酸性，此时可能有甲醛色素产生。此种色素无光泽，不溶于水，乙醇，二甲苯等。对于这种色素可用下列方法除去。     1  浓氨水1 ml，75%乙醇200 ml。切片脱蜡后置溶液中30 ’或较久→流水洗→染色。     2  1%氢氧化钾1 ml，80%乙醇100 ml。切片脱蜡后置溶液中10 ’ →流水洗5 ’ →80%乙醇5 ’ →蒸馏水洗→染色。
㈣ 除铬沉着物   有些组织用含铬的Ｚenker氏液等固定，致有铬沉淀物。可应用盐酸乙醇溶液，或用5%碘酒和5%硫代硫酸钠水溶液处理。
二、染色后的处理 ㈠  染色后的脱水  对于大多数的切片，染色后必需要经过脱水。95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 ’→100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各 5 。’ ㈡  染色后的透明   组织经过脱水核透明后会产生一定的折射率，为防止空气中的有色素的细小颗粒沉淀在组织中的不良影响，需加透明处理以使组织切片清晰。二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5 ’ 透明。
  三、  染色封固剂     组织制片需随时检查和保存，故要有盖玻片封固。通常用中性树胶，此封固剂质量已普遍应用。   
                     第五章      苏木素、伊红染色的           应用及其配制
          一、苏木素染色的应用 （1）HE染色在医学领域中的组织学、生物学、病理学及其细胞检查中，是必不可少的最基本染色方法。 （2）在病理诊断（活检）、教学、科研工作中都被广泛应用，对细胞学的观察也具有重要价值。 （3）HE染色主要显示各种组织正常成份和病变的一般形态结构，病理组织学的基本知识大部分都是从观察HE染色切片中获得的。
二、HE染液的配制 ⒈ 苏木素染液 苏木素又称苏木精，为植物染料，是从苏木树树心提炼出来的天然染料（淡黄褐色粉末），易溶于酒精、甘油、加热可溶于水。苏木素本身没有染色能力，配制时必须加入含金属的媒染剂（钾明矾），才能达到染色之目的，配制后还需经过氧化成熟产生苏木红才能进行染色（有自然氧化成熟和人工氧化成熟）。
配制法有下列几种 （1）哈瑞氏（harris）苏木素染液 最常应用染色时间为5’—10’ 配制                                  ① 蒸馏水             1000ml                                        ②  苏木素            3—5g ③  碘酸钠            1g ④  钾明矾            50—80g ⑤  水醋酸            20ml 其优点是：  配后即可应用染色力较强。 其缺点是：  极易产生金属膜沉淀。
  （2）埃利希（Ehrlich），苏木素染液    配制    ①  无水乙醇         100ml    ②   甘油            100ml    ③  苏木精           2g    ④  钾明矾           2—3g    ⑤   醋酸            5—10ml 置于阳光下自然氧化3个月左右成熟。 其优点是： 染色结果甚佳，贮存愈久染色愈强，而且不需分色。
⒉   伊红染液        苏木素染色后，需用伊红染料作对比染色，伊红着色深浅不一，如胶元纤维粉红色，肌纤维深红色、红血球橙色。这样细胞核、细胞桨着色清晰、鲜明，便于鉴别。
        伊红常用配制有两种 1）0.5%--1%水溶性伊红乙醇液     伊红y  0.5--1g+95%乙醇25ml+蒸馏水75ml+醋酸 1—2滴。 2）伊红 B 0.5g+80%乙醇100ml溶解后用
  石蜡切片染色程序          切片脱蜡、二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5’—10’ →无水乙醇5’→95%乙醇ⅠⅡ各5’ →75%乙醇 5’ →自来洗5’水冲—10’ →蒸馏水洗→染细胞核（苏木素）3—5’ →自来水洗→分化（0.5%盐酸水）→流水冲30’ →返兰→染细胞浆（伊红）1—2″→95%乙醇Ⅰ、Ⅱ→100%乙醇Ⅰ、Ⅱ→二甲苯透明→封片（中性树胶）→贴号。
HE 染色结果 细胞核兰色   细胞浆红色
第六章       特 殊 染 色
  一、殊染色的概念及意义        特殊染色为常规染色（即苏木素、伊红）的必要补充，又称选择性染色，只有相对的特异性，如PAS阴性反应它有糖元。
意义： （1）特染能显示在常规染色切片中不明显的部分，如革兰氏染色、细菌染色。 （2）区别HE染色中不能鉴别的组织病变，如VG染色区别胶元纤维和平滑肌。 （3）显示某些常规染色中不能着色的物质，如网染才能显示网状纤维，常规HE染色是染不出来的。 因此，特殊染色也是制片染色中不可缺少的组成部分，它在病理诊断常着辅助作用，也为科研提供依据。
二、学习特染技术应掌握的重点                   （注意事项） （1）染色方法的成败，应该在温度、浓度、时间和PH值等方面找原因。 （2）注意特染的应用范围，如某种病变应用什么方法染色才能达到目的，一般先在HE切片所见的要求去选择适当的特染方法，一种或多种。
（3）必须掌握各种特殊染色的结果，避免导致错误的结论或严重的误诊，如在网染时把胶元纤维误以为网状纤维。 （4）尽量要阳性切片作对照，便于选择特染方法，并与HE切片作对照。 （5）特染的组织，在其固定、脱水根据要求选择。所用的器皿都必须化学清洗。
三、玻璃器皿的清洁       在病理实验室可用的玻璃器皿，都必须经过清洗干净才能使用，清洗的方法依玻璃器皿的新旧而不同。
1、新购玻璃器皿的处理        对于新购买的玻璃器皿应先用洗衣粉浸泡洗刷，自来水冲洗后再用1—2%盐酸水溶液浸泡数小时后，用自来水冲洗干净，必要时可用少量蒸馏水洗2次。
2、使用后玻璃器皿的处理        每次使用后的玻璃器皿都必须及时彻底清洗干净，以供下次实验之用，如轻视这一步骤，可用的玻璃器皿不够干净，则会影响染色效果，甚至导致染色失败，特别在酶组化和银离子反应操作过程中更有严格的要求，使用后的玻璃器皿在一般清洗后，还要求用硫酸清洗液浸泡。
硫酸清洗液配制 重铬酸钾            80g 自来水             1000ml 浓硫酸（工业用）   120m 新配制的清洁液为红褐色，反复使用一段时间后，慢慢变成绿色，说明清洁液已失败，不能继续使用应重新配制。
3、玻璃器皿的清洗方法   ① 任何玻璃器皿都必须用自来水冲洗，然后把残余药液或染液洗去。 ② 用毛刷沾洗衣粉擦干净。 ③ 自来水冲洗，蒸馏水洗2次。 ④ 把晾干的器皿轻轻置入清洁液浸泡数日。 ⑤ 取出器皿，用自来水把器皿内外彻底冲洗干净，最后用蒸馏水洗2次。 ⑥ 把玻璃器皿倒置于有孔架上自然晾干或温箱中烤干，最后存放橱内备用。
  四、常用的特染
一、胶元纤维染色（V   G 染色） ㈠  胶元纤维的分部组成成分        胶原纤维是结缔组织中的三种纤维之一，分布最为广泛，含量最多。主要分布于真皮、腱、韧带、骨、透明软骨、动脉、肠壁  、子宫和基底膜等。胶原纤维具有韧性大，抗拉力强的特点。胶原纤维单位主要由纤维母细胞合成。
㈡ 胶元纤维染色应用        胶原纤维染色在病理诊断上主要用于鉴定梭形、纤维形细胞肿瘤的组织来源；常常要在纤维、平滑肌和神经三者之中作出选择。还能使用于其他的情况下，如观察动脉硬化的心脏，在H·Ｅ切片中，心肌内散在的小疤痕灶和心肌均被染作红色，而作胶原纤维染色可将胶原组织和上肌明显地区分开来。早期肝硬化用胶原纤维染色，也可使小叶之间少量增生的胶原纤维突出地显示出来。
  苦味酸——酸性品红法 1． VG 染液试剂配制 1%酸性品红         10ml 苦味酸饱和液     。 90ml 此液常分别配制临用时加以混合，不能久用。
【染色步骤】 （1）组织固定于10%早醛液中，常规脱水包埋。 （2）组织切片脱腊至水。 （3）V—G染液2—5’（酸性品红1：苦味酸饱和液4--6） （4）倾去染液，无水酒精急速脱水，用滤纸吸干。 （5）二甲苯透明，中性树胶封儿。
【结果】         胶元纤维呈红色，肌纤维、胞质及          红细胞黄色。