淡若水

切片有裂纹及灰染怎么办，我曾经想过很多办法都没有解决好这个问题，下面是我在网上看见的类似我的问题，敬请同行指教：

淡若水

最明显的是细胞丰富的宫内膜腺癌和这两张图片的结肠病变。我曾经想过很多办法：对裂纹,我采取过重新冷冻腊块，选用新的刀片，将切片厚度切的更薄，如4’，染色完成后,经过梯度酒精,再进入二甲苯,然后再加盖片,这些措施,可以使切片有点改善,但是还是没法根本解决问题。片子发灰的问题，我试过延长染色时间，和延长分化时间，效果也是收效甚微，殷切希望同道给予指点。

淡若水

谢谢版主的指点。

淡若水

我的脱水透明浸蜡程序大概如下：

1.  80% 酒精          30分钟－6小时，
2.  90％酒精          30分钟－6小时，


（以下是进入自动脱水机）
3.  93％酒精             30分钟
4.  95％酒精             30分钟
5.  95％酒精             30分钟
6.  97％酒精             30分钟
7. 100％酒精            30分钟
8. 100％酒精            30分钟－12小时（有时需要过夜）
9.      二甲苯             30分钟
10.    二甲苯             30分钟
11.    二甲苯             30分钟
12.       石蜡（50－52度） 30分钟  （缸温 70度，以下同）
13.       石蜡（50－52度） 30分钟
14.       石蜡（60－62度） 30分钟

切片机是徕卡的轮转式切片机，刀片是用的徕卡的818.
因为标本量不算太大，大约每年1200例左右，所以试剂一般一周更换一次。一般组织基本还是比较满意，就是宫内膜癌和上面那种细胞丰富的消化道腺癌出现裂纹和片子发灰的情况，问题究竟出在那儿？请版主和其他同道提出宝贵意见

[ 本帖最后由 淡若水 于 2008-7-18 20:42 编辑 ]

淡若水

切片前我的腊块只是放在冷藏室的冷水里，连冰块都没有。应该不存在过冻的问题，只是会不会冷冻不够？
       放入冷水前，我是让蜡块完全凝固了，才放在冷水里的，蜡块一般不会产生裂纹。
       因为怕脱水机过夜遇到打雷、停电或者其他机器故障，所以常常只走到纯酒精一步，就关机，第二天上班再开机，走完后面的程序。这样处理的结果，一般宫内膜和小组织，切片也没有什么异常。只有宫内膜癌和我下载的肠道细胞丰富的病变，才出现这样的情况。
      以后我遇到宫内膜癌的时候，再试一试，纯酒精不放长了，看单独脱水的效果怎样。
      至于片子发灰的问题，用同样的苏木素，其他组织又没有这样的现象。似乎也不好用苏木素解释。下面是一张甲状腺的片子，胞浆也没有这种现象啊。


[ 本帖最后由 淡若水 于 2008-7-19 12:06 编辑 ]

淡若水

谢谢版主，用心给我回了帖子。如果按照版主的意见，确实解决了我的问题。那倒是解决了我多年来的一个大难题。
酒精97％的浓度，是个大概，是利用纯酒精浓度不够后的再利用。前面的95％的酒精，我是用的工业酒精，这样成本可以降低。（会不会影响免疫组化，我不知道，但是似乎对HE片子没有影响）如果这一缸的浓度低于了95％，我就废弃不用了。因为杂志上有文章介绍，高浓度的酒精里溶有较多脂肪，如果浓度降低后，继续前移使用，会影响制片效果。

淡若水

我用的上海的

淡若水

版主给我建议的脱水程序，我试了一下，蜡块确实有改进,过去胶质丰富的甲状腺病变，按我的方案做出来的组织块。又硬又脆，如果不经过特殊处理，而是按普通方法切片的话，滤泡中的胶质完全成粉末状。现在软多了，皮肤组织也好切多了。谢谢了。
在回答其它朋友的问题时，我查了下笔记，《诊断病理学杂志》07年P474,《关于组织切片裂隙的处理》一文，也是针对切片有裂隙的问题的，看来这个问题还有一定的普遍性。文中用5mmol/L的盐酸溶液处理蜡块，我试过，用它处理变硬脆的甲状腺，效果还不错。文章说的是淋巴结等富于细胞的组织。看来我的宫内膜腺癌也应该属于这种情况了，我再试一试。

淡若水

谢谢楼上的意见。能不能提供一下你的脱水、透明和浸蜡的程序，很想看看你的程序是怎么设置的，我会仔细考虑你的意见的。
过去我对标本的固定这一步，没有足够的重视，现在我注意到了这个问题。

不过，今天中午，我们这儿打雷，可能是停了一会儿电，程序显示屏变成了空白，机器停止了运行。幸好脱水机没有被打坏，但是脱水机里我设的几种程序，全变成了相同的一种。我赶快重新设过，才走完了全程，没有耽误包埋切片。
还好不是过夜，如果标本停在了二甲苯里，那标本就废了。
我最怕的是，放入脱水机的标本是唯一的小块组织，一旦出了问题，连补救的机会都没有了。

当然我用的是国产的脱水机，5.7万，也不是好高级的，可能进口的高级脱水机没有这样的顾虑吧？

至于更换酒精，我是用酒精比重计测试过，再更换的。尽管我的标本不是太多，但是除非标本实在太少，一般一周后，最后一缸的酒精最多就只有98％的浓度了，要保证脱水彻底，就只有将浓度降低了的酒精移往前一缸了。

[ 本帖最后由 淡若水 于 2008-8-6 20:04 编辑 ]

淡若水

卫生部的《临床技术操作规范?病理学分册》中关于脱水透明浸蜡的意见是这样的：

㈦常用固定液
...
2．乙醇－甲醛（酒精－福尔马林，AF）固定液
甲醛（40%） 100ml
95%乙醇 900ml
［说明］一般组织块经乙醇－甲醛固定1～2小时后，即可移入95%乙醇内脱水。
...
二、常规石蜡包埋组织切片（常规切片）的制备
....
㈢常规切片的手工操作（步骤次序和各步骤的持续时间）
1．水洗：用流水冲洗已经固定的组织块30min。
2．脱水（常温下）
（1）乙醇－甲醛（AF）液固定     60~120min
（2）80%乙醇             60~120min
（3）95%乙醇Ⅰ         60~120min
（4）95%乙醇Ⅱ             60~120min
（5）无水乙醇Ⅰ         60~120min
（6）无水乙醇Ⅱ         60~120min
（7）无水乙醇Ⅲ             60min
［注意事项］①未经充分固定的组织不得进入脱水程序。②用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5～10倍以上。③自低浓度乙醇向高浓度乙醇逐级移进脱水。 ④脱水试剂应及时过滤、更换（500ml乙醇可用于500个组织块脱水；加入硫酸铜的无水乙醇变蓝时，提示需要更换）。⑤较大组织块的脱水时间长于较小者，应将两者分开进行脱水。⑥组织置于无水乙醇内的时间不宜过长（以免硬化）。⑦丙酮脱水性能强，会使组织块过缩、硬脆，不宜用以替代无水乙醇。
3．透明
（1）二甲苯Ⅰ                   20min
（2）二甲苯Ⅱ                          20min
（3）二甲苯Ⅲ                          20min
［注意事项］①二甲苯的容积应为组织块总体积的5～10倍以上。②组织块在二甲苯中透明的时间不宜过长（以防组织硬、脆），并依不同种类组织及其大小而异；组织呈现棕黄或暗红色透明即可。③二甲苯应及时过滤、更换。④组织经二甲苯适度处理后不显透明时，常提示该组织的固定或脱水不充分，应查找原因并妥善处理。
4．浸蜡              
（1）石蜡Ⅰ（45~50℃）     60min
（2）石蜡Ⅱ（56~58℃）     60min
（3）石蜡Ⅲ（56~58℃）               60min
［注意事项］①熔化石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中（70
℃）进行，不得用明火加温。②熔蜡的容积应为组织块总体积的5～10倍以上。③组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程，应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带入熔蜡中。④浸蜡时间适宜，过短时浸蜡不充分（组织过软），过长时组织硬脆。⑤熔蜡应及时过滤、更换。

以上是卫生部的技术操作规范上的。

我的固定液是用的普通的10％福尔马林，没有采用中性福尔马林的配方。
低浓度的酒精我是采用的高浓度的酒精，工作一段时间浓度降低后的。纯酒精则从第六缸只用到第4缸，就废弃不再用了。一来是为了节约酒精，二来也是觉得用高浓度的酒精加水配制低浓度的酒精麻烦。而且随着每天标本的处理，每天的酒精浓度都在变化。随便那种浓度的设置都只是理论上的浓度。
不知道这样的处理有什么不妥当没有？

[ 本帖最后由 淡若水 于 2008-8-2 07:02 编辑 ]