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在日常病理组织制片及染色过程中，甲醛和二甲苯作为病理常规试剂被大量应用。这些试剂具有强烈的刺激性和挥发性，不仅污染环境，而且严重危害身体健康。因此，寻找一种对人体无毒无害且安全的甲醛和二甲苯替代品，已成为病理技术工作者的一种迫切愿望。本文将环保型GS( greenspecimen，GS) 组织样本制备及染色套液应用于病理技术工作中，收到了理想的制片效果。
1 材料与方法
1. 1 标本选取北京军区总医院临床送检的各种活体组织标本，将其分为两组，一组采用传统石蜡制片方法; 另一组采用环保试剂制片方法; 比较二者制片后的各种染色效果。
1. 2 GS 环保试剂GS 组织样本制备套液及GS 病理切片
染色套液由哈尔滨格林标本技术开发有限公司研制生产。
1. 3 方法
1. 3. 1 传统石蜡制片法组织经4% 中性甲醛固定，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚4 ～ 5 μm。
1. 3. 2 GS 环保试剂制片法新鲜组织标本: ①经固定液Ⅰ1 h、固定液Ⅱ 3 h; ②脱水液Ⅰ × 2，分别为40 min、1 h，脱水液Ⅱ × 2，分别为30 min、1 h; ③透明液Ⅰ 1 h，透明液Ⅱ90 min; ④浸蜡液Ⅰ、Ⅱ各90 min; 石蜡包埋，切片，厚4 ～5 μm。
1. 3. 3 传统HE 染色①切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5 min;
②无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇各2 min，流水洗; ③苏木精染8 min，流水洗; ④1%盐酸酒精分化数秒钟，流水洗; ⑤1%氨水返蓝1 min，流水洗; ⑥1% 水溶性伊红染1 min; ⑦70%乙醇、95%乙醇各10 s，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各2 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各2 min，中性树胶封固。
1. 3. 4 GS 环保型染液HE 染色①切片经脱蜡液Ⅰ 5 min，脱蜡液Ⅱ 5 min，流水洗2 min; ②苏木精染液3 ～ 5 min，流水洗10 s; ③分化液2 ～ 3 s，流水洗1 min; ④蓝化液1 min，流水洗1 min; ⑤伊红染液1 ～ 3 min，流水洗3 s; ⑥除浮染液3 s，沥干残余试剂; ⑦除水透明液1 min，沥干; ⑧透明液3 min，无苯封片胶封固。
1. 3. 5 免疫组化染色乳腺组织采用PV-6000 通用二步法进行p63 染色，具体染色步骤同常规。
1. 3. 6 组织化学染色胃黏膜组织进行PAS 染色，肾组织进行PAMS 染色，具体染色步骤同常规。
2 结果
2. 1 GS 液制作的组织蜡块在切片中感觉组织块软硬适中，切片厚薄均匀，连续性好，与传统方法制备的组织蜡块切片效果基本相同。脂肪组织、子宫肌瘤及皮肤等组织切片效果优于传统方法。采用环保型GS 染液进行HE 染色，渗透力强，染色速度快，组织结构清晰，色彩鲜艳，核浆对比分明，与传统HE 染色结果相比无明显差异( 图1) 。
2. 2 GS 液制作的石蜡切片乳腺组织的免疫组化p63 染色结果显示，细胞内抗原成分保存良好，阳性结果定位准确，背景清晰，与传统方法染色效果基本相同( 图2) 。肾组织行PAMS 染色，胃黏膜组织行PAS 组织化学染色。结果显示，肾小球基底膜和胃组织中的中性黏液染色清晰，色泽鲜艳，阳性物质定位准确，与传统方法染色效果相同( 图3，4) 。
3 讨论
在组织处理过程中，组织固定至关重要，它直接影响着各种染色效果。甲醛对组织的渗透力强、组织固定均匀、组织收缩小，尽管它具有高毒性，但由于其成本低、能较好地保存组织结构，所以至今仍广泛被人们所接受。甲醛主要缺点: ①易挥发，具有较强烈的刺激性和腐蚀性，而防护又极为困难; ②甲醛存放过久易产生白色沉淀( 即三聚甲醛) ，而影响组织标本固定效果; ③甲醛容易氧化变成甲酸，使溶液变
为酸性，导致标本酸化，严重时影响细胞核的染色效果; ④不能固定肝糖原和尿酸; ⑤废液需特殊处理，不能直接排入管道，且费用较高; ⑥以醛类为基础的固定液( 如甲醛) 处理标本，可引起组织内广泛的蛋白质交联，免疫组化染色时需进行抗原修复。研究显示，无交联作用的醇类固定剂在保存DNA 方面比醛类固定剂效果更好。而单纯用乙醇类固定液，易导致核固缩、细胞空泡出现、组织变硬、变脆等缺陷。理想
固定液应该是低毒、不同染色均可达到最佳效果，同时还有利于DNA/RNA 生物大分子的修复，以便进行分子生物学研究。
虽然国外已有使用甲醛、苯类等替代产品进行病理制片的相关报道［1，2］，但国内相关报道较少。本文采用的国产GS固定液为环保型无醛复合固定液，它无色、无刺激性、低挥发性、不含甲醛，具有绿色环保、易生物降解、使用后不会对环境产生危害的特点。经大量实际应用，GS 固定液与传统甲醛固定液处理的组织制片效果基本相同，完全可以取代甲醛对组织标本进行固定: ①组织渗透性强，能缩短脱水时间; 不会产生组织脱水过度或脱水不足，组织软硬度适中，尤其在脂肪、淋巴组织及子宫肌瘤等组织的处理较传统方法效果好;②能保持良好的组织结构，保护细胞膜的完整性; ③有较强的固定、脱水、脱脂兼硬化作用，不易导致组织过度收缩，无细胞空泡与核固缩现象产生; ④经GS 固定液保存的大体标本，取材时触之感觉良好，易于分离并切取较薄的组织块;可去除脂肪组织标本的黏滑感，易清洁; ⑤能最大限度地保护组织中的抗原和核酸不被破坏、降解或扩散，免疫组化检测与传统制片效果一致; ⑥回收简便易行。二甲苯极易挥发，是一种对人体具有较强毒害作用的有机化学试剂［3］。在组织处理过程中，若二甲苯浸泡时间过长，易产生组织收缩和硬化现象，使含纤维丰富的组织( 如子宫肌瘤) 变得坚硬难切，使含胶质较多的组织变脆，使含脂肪较多的组织脱脂不净。我们采用GS 环保型脱蜡剂、透明剂和封片剂，收到了理想效果。这些试剂均为非苯、无毒型复合试剂，可以替代二甲苯进行脱蜡和染色脱水后的透明处理以及封固，彻底根除了二甲苯对人体的伤害及其对环境的污染。GS 脱蜡剂使组织切片脱蜡彻底、速度快; GS 透明剂对组织渗透力强，处理组织软硬度适中，组织标本即使较长时
间浸泡也不会出现明显的收缩和硬化现象。GS 苏木精染色液为无汞染液，对人无危害，对组织亲和力强，染色速度快，不易产生氧化膜而污染组织，切片长期存放细胞核也不易褪色，染液使用时间长，镜下组织切片色彩鲜艳，细胞结构清晰，核浆对比分明，与传统HE 染色效果一致。
参考文献:
［1］ Iesurum A，Balbi T，Vasapollo D， et al． Microwave processing and ethanol-based fixation in forensic pathology［J］． Am J Forensic Med Pathol，2006， 27: 178 － 182．
［2］ Acton A，Harvey T，Grow MW． An examination of nonformalinbased fixation methods for xenopus embryos［J］． Dev
Dyn，2005，233( 4) : 1464 － 1469．
［3］ 高蓉梅，彭凤翔，李永春． TO 型生物制片透明剂取代二甲苯在病理制片中的应用［J］． 诊断病理学杂志，2009， 12( 2) : 147．
转载于《诊断病理学杂志》2011 年8 月第18 卷第4 期作者：田玉旺，朱红艳，李琳，苗金红，朱培双，邢宜作者单位：北京军区总医院病理科，北京100700