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Antigen Retrieval Immunohistochemistry: Review and Future
Prospects in Research and Diagnosis over Two Decades
Shan-Rong Shi, Yan Shi, and Clive R. Taylor
Department of Pathology, University of Southern California Keck School of Medicine, Los Angeles, California (SRS, CRT) and Department of Pathology,
New York University, Langone Medical Center (YS).
Summary
As a review for the 20th anniversary of publishing the antigen retrieval (AR) technique in this journal, the authors intend
briefly to summarize developments in AR-immunohistochemistry (IHC)–based research and diagnostics, with particular
emphasis on current challenges and future research directions. Over the past 20 years, the efforts of many different
investigators have coalesced in extending the AR approach to all areas of anatomic pathology diagnosis and research and
further have led to AR-based protein extraction techniques and tissue-based proteomics. As a result, formalin-fixed paraffinembedded
(FFPE) archival tissue collections are now seen as a literal treasure of materials for clinical and translational
research to an extent unimaginable just two decades ago. Further research in AR-IHC is likely to focus on tissue proteomics,
developing a more efficient protocol for protein extraction from FFPE tissue based on the AR principle, and combining the
proteomics approach with AR-IHC to establish a practical, sophisticated platform for identifying and using biomarkers in
personalized medicine. (J Histochem Cytochem 59:13–32, 2011)
http://jhc.sagepub.com/content/59/1/13.full.pdf+html

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我和抗原修复技术

石善溶

      我是华西1957年医本科毕业生，毕业后留校作耳鼻喉科住院医师。1981年考取教育部留学生，赴美国波士顿，在哈佛所属麻省眼耳鼻喉医院及总医院进修耳鼻喉病理和免疫组织化学。在进行一项自行设计的应用单克隆抗角蛋白抗体对四川地区鼻咽癌组织的免疫组织化学研究过程中，采用酶消化法以恢复因甲醛固定导致的组织抗原改变，使多年收藏的石碏包埋组织能够精确地再现各种角蛋白的分佈规律。在显微镜下看到的清晰图像激起了我对免疫组织化学这门新兴学科的浓厚兴趣。当时，我也正在Schuknecht教授的耳病理实验室学习。对他多年来收藏的人体颞骨宝库，我深感应用免疫组织化学于甲醛固定、火棉胶包埋的耳组织切片的必要性。在进修二年将结束时，我努力地试图作出成果。虽然取得了一些阳性结果，但距目标尚远。应该说，从那时候开始，我树立了一个牢固的信念：如何挽救因甲醛固定而改变了的抗原性以满足免疫组织化学染色在常规石碏切片上的广泛应用。查阅文献，广大的病理学者们从1970年以来，就已经对这一重要课题付出了大量艰辛劳动。因为人们认识到免疫组织化学在石碏切片上的应用不仅对临床病理诊断，而且对于病理机制的研究均扱为重要。百余年来积累于全世界的数以万计的石碏组织标本是人类生物医学研究领域的巨大宝库，而且是不可能被取代的研究源泉。因此，找到一种简便而有效的抗原修复技术就是打开这一宝库大门的金钥匙。

      我于1985年回国，仍在耳鼻喉科作鼻咽癌免疫组织化学研究。1987年应邀赴日本作学术交流，后赴美国，在一家生物技术公司作顾问。正好，该公司刚研制成功一种号称为鳞癌标记的单克隆抗体。但是，只能用于冷冻切片的免疫组织化学染色。他们希望我能设法将其用于石蜡切片，促使我进一步开发抗原修复技术的强烈愿望。限于我当时的知识水平，只能作一些改良固定包埋技术来达到目标。不过，我深刻地感到寻求抗原修复技术的必要性和紧迫性。不幸的是，该公司迅即倒闭，我便失去工作机会。为谋生计，我在聖荷西州立大学旁边租了一小间廉价卧室，並在一家由越南华侨开办的大众超级市场打工。我在卖肉类的柜台工作，并不很累。但班头是一位台湾人，黑脸膛，性凶猂，人称“努努”。他对我特凶狠，从开工到下班，不仃地对我横加指责，其粗暴蛮横无理之程度令人难以置信。然而，正是这种胯下之辱迫使我卧薪尝胆，夜以继日地到州大图书馆查阅浩繁文献。集中解决一个关键问题：甲醛所致蛋白质的改变是可逆的或不可逆的？如果是不可逆的，则无法修复。如果是可逆的，在什么条件下可以修复？当时，我必需靠翻阅堆积如山的化学及生化文献索引来找到答案。我收集了图书馆丢弃的废纸，抄写有关的文献资料，由文题到全文，从近到远，一直查到1947年，才发现一组文章探讨甲醛与蛋白质的化学反应。我在图书馆书架的顶层找到了已经尘封多年的杂志合订本。仔细阅读全文，在字里行间找到一句关键性答案。甲醛引起的某些蛋白质侧链间的交联结构，必需在高温或强硷的条件下，通过水解而恢复。虽然找到了答案，但我当时没有条件来作任何试验。何况我的记忆中还保留着经典教科书的结论：蛋白质经过高温加热超过摄氏60度即刻变性，而失去抗原性。

      1988年夏，我接受一位日本友人的邀请，赴福岛医科大学作内耳免疫电镜研究，为期一年。由于时间太短，我无暇考虑抗原修复技术。次年夏天，我应邀返美。因受六四影响，赴美签证十分困难。我数次拎着行李，奔走于上野车站，东京街头以及美国大使馆，幸有朋友相助，终于获得签证，再返旧金山市。通过向加州地区的生物技术公司联系，受邀到BioGenex面试。面试时，负责该公司开发研究的白人博士向我提出了一个尖锐的问题：“你能够为这家公司作何贡献？”。我立即回答：发明一项抗原修复技术，能够将免疫组织化学技术用于石蜡切片。他立即半带叽讽地说：”你如果能够发明这样一项技术，你将会名闻全世界”。我懂得他的言下之意：多少比你有水平的知名学者都束手无策，你多半不会成功。不过，我还是被雇用了。数月后，这位博士从美国病理学年会带回一篇资料，关于一种增进免疫组织化学染色的方法。有人报告用硫酸锌溶液滴加在石蜡切片上，以后再作免疫组织化学染色，可以增强效果。他叫我试用，经过多次试验后，毫无效果。这时，我突然产生一个念头：何不试用高温加热处理？正巧，手边就有一台微波炉。我开始将滴加有硫酸锌溶液的石蜡切片放到微波炉内加热，但溶液很快干掉，大量化合物沉淀于玻片上，无法染色。我改用一个装切片用的塑料缸子，盛满水溶液再加热煮沸。约5分钟后，再补充失去的水分以免干燥。使我大为吃驚的事终于发生了：经过这样处理后的石蜡切片，免疫组织化学染色呈现鲜明的阳性结果，背景出奇地清晰。开始，我几乎不相信这是可能的事实。经过多次试验，共52抗体，90%均获得满意的效果。就这样，这一极为简便而效果卓著的抗原修复技术 (Antigen retrieval)就此在1990年诞生了。公司对于这一发明也十分重视，特别邀请了三位美国最著名的免疫组织化学专家作现场技术鉴定。並将我的技术方法带回，经过他们的大学实验室重复验证后，正式公认了这一新技术。公司也申请了专利权。我写了一篇关于这一新技术的文章准备发表，也由于人为的干扰因素，儿乎拖延了将近一年的时间未能送出文稿。然而，这一新技术已经广为传播，幸好我在文稿上加上老板的名字，通過他的批准，将文稿送交组织化学和细胞化学杂志 (Journal of Histochemistry and Cytochemistry)，当时的总编辑，杰出的神经病理学家Paul Anderson 教授迅即决定接受发表于该刊1991 年第6期1。

      由于这一新技术的方法非常简单，煮沸石蜡切片十分钟即可收到满意的免疫组织化学染色效果。文章发表后，迅即被全世界病理学，组织学，细胞生物学，畜牧兽医学等一切涉及形态学的领域所采用。抗原修复技术正巧产生于一个青黄不接的技术交替时代：一方面，奠基于石蜡切片上的传统形态学的病理诊断仍然主宰当今临床医学；另一方面，分子生物学的飞速发展又迫切需要传统形态学的革新。近数十年来，许多科学家为寻求这一抗原修复技术进行了大量的研究。出乎意料的被这一极为简单的技术满足了多年的渴望。因而，抗原修复技术被誉为免疫组织化学的革命性突破，是一座里程碑 2,3。抗原修复技术将病理学界在应用免疫组织化学而发表的浩繁文献分割成两个时代：前、后抗原修复技术时代，1991年发表的文章就是分水岭 4,5。

      我于1992年夏，受聘于南加州大学病理学系任职，历经助理教授，副教授，教授至今。除临床，教学外，主要从事抗原修复技术的研究，发表论文50余篇，专书一本 6。主持全美及国际抗原修复技术讲习研讨会十余次。2004年赴北京大学基础医学院讲学，并在中华病理学会北京分会讲学，受到热情接待和鼓励。2007年，受聘为北京大学基础医学院客座教授。我是美国病理学会以及组织化学学会会员，多年来担任组织化学和细胞化学杂志以及应用免疫组织化学和分子形态学 (Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology) 的编委，中华病理学杂志海外编委，并为十多种杂志审稿。2003年起升任组织化学和细胞化学杂志副主编。2006年起担任组织化学学会常务理事以及出版委员会委员。最近，应波士顿一家出版社之邀，正在编写一本以抗原修复技术为基础的新书。

我已老矣。人到老年总爱回首往事，尤其是自己的童年和青年时代。华西坝的美丽校园风光加上大学求学时代的欢声笑语，在记忆里永远是如此清晰，任何时候都能够听见钟楼的钟声，看到荷池边的野草，更有老师们在课堂上的谆谆教导。应该说华西母校是我一生从事研究的启蒙发源地，尤其是毕业后在病理科进修班的训练，奠定了形态学分析的基础。

回首往事，人生悔恨的事情太多了。然而，悔之晚矣，悔之无益。不如总结主要方面以供后来者参考。首先，我在接受教育的过程中，只片面重视学术知识而忽视全面培训。使自己变成很片面的人，不懂得人际、社会关系是何等重要。这是我一生的致命伤。否则，我应该比现在的处境好得多。另外一奌值得一书的是没有抓紧一切时间和机迂。年青时，总觉得来日方长，及至明白时，为时已晚，追悔莫及。对此，我很想奉劝年青一代校友们，应该经常把自己放到老年的处境，充分感受到 “高堂明镜悲白发，朝如青丝暮成雪” 的紧迫心态，决心成为不虚渡年华的人。