CD4 ,CD8 免疫组化
最近在做冰冻切片的CD4,CD8免疫荧光，采用了脾脏冰冻切片作为阳性对照，可是在作预实验时阳性也染不出来，我的操作如下
1、小鼠灌流，PFA固定，蔗糖脱水，oct包埋，液氮速冻，切片厚度10μm
2、切片以PBS洗涤3次，0.3%过氧化氢处理10min（本来我的免疫荧光从理论上说不需要这一步，可是我在以往做脑片的染色时发现经过这一步才能得到结果，很奇怪！），PBS洗涤3次，抗原热修复10min，自然冷却，PBS洗涤3次
3、10%羊血清溶于3%triton中封闭并透膜30min，不洗，直接甩去液体，再擦干周围水分，加入梯度稀释的一抗（ebioscience）1:100，1:200，1:400，1:500。4℃过夜
4、PBS洗涤3次，加入二抗1:100（进口分装immunoresearch）37℃1h，PBS洗涤3次
5、hoechst33258染核，PBS洗涤3次，荧光显微镜观察
结果很奇怪，灌流后其他组织都变白了，可是脾脏仍然是褐红色；
染色结果切片过厚，细胞有重叠，不便于观察；
另外组织有自发荧光，自发荧光呈环状，环内细胞无自发荧光，但也不阳染，很发愁，请大家指教！非常感谢！
另我的抗体是ebioscience的，14-0042 affinity purified anti－mouse CD4(L3T4)
14-0081 affinity purified rat anti－mouse CD8(CD8a)
应用里可用于IH/F
